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什么是吸光度？
从广义上讲，吸光度是光与物质相互作用的过程。当光照射到某种物质上，该物质吸收部分光时，我们就称这一现象为吸光度。当然，被吸收的光并未消失，而是在吸收分子被激发的过程中，转化为热能或化学能。吸光度是我们日常生活中随处可见的物理过程，物体的颜色就源于此：阳光等白光包含可见光的所有颜色，当白光照射到绿色的草地时，草地会吸收除绿色外的所有颜色光，而绿色光被反射出来，这便赋予了草地绿色的外观。
吸光度检测的理论基础
比色皿与微孔板中的检测路径
传统的吸光度检测在比色皿中进行：将具有已知吸光度特性的分析物溶液装入比色皿，吸光度读数仪向样品发射已知强度的光，再检测样品另一侧的光强度。未到达检测器的光要么被样品吸收，要么被散射。其中，散射光的影响需通过检测合适的空白样品单独确定，并从总信号中扣除，以获得目标物质的纯吸光度值。
吸光度检测结果 —— 透射率、吸光度与光密度
能够穿过样品的光占比称为透射率（Transmission），通常以百分比表示（图 2）。溶液中分析物含量越高，光被吸收得越多，透射率就越低；而吸光度（Absorbance）则指被分析物吸收的光占比，等于透射率以 10 为底的对数的绝对值 ¹。以下是描述透射率与吸光度关系的数学公式及实例：
透射率：T =Iout /Iin
吸光度：A =-log10T
表 1：透射率与对应吸光度值示例表
| 透射率 | 吸光度 |
| 0.1 （或 10%） | 1 OD （光密度单位） |
| 0.01（或 1%） | 2 OD |
| 0.001（或 0.1%） | 3 OD |
化学与生命科学中的吸光度检测 —— 定量溶液中的物质
吸光度检测的结果通常以透射率或光密度（OD）表示，但检测的核心目标是定量溶液中的物质，因此关键问题在于如何将检测信号转化为浓度值。通常有两种方法：一是利用比尔 - 朗伯定律（Beer-Lambert Law），二是在检测未知浓度样品的同时绘制标准曲线。
比尔 - 朗伯定律
比尔 - 朗伯定律描述了吸光度、光程长度与吸光物质浓度之间的关系：
A = c × d × ε
变形为浓度计算公式： c = A / (d × ε)
其中：
•A = 吸光度（无单位）；
•c = 物质浓度（单位根据检测需求而定，如 mol/L、μg/mL）；
•d = 光程长度（光穿过样品的距离，单位：cm）；
•ε = 摩尔吸光系数（特定物质在特定波长下的固有常数，单位：L/(mol・cm) 或 mL/(μg・cm)）。
该定律表明，吸光度与 “浓度 × 光程长度 × 摩尔吸光系数” 呈线性关系 ²。光程长度即光穿过样品的距离，例如比色皿的标准光程长度为 1 cm；摩尔吸光系数是特定物质在特定波长（通常为该物质的最大吸收波长）下的特征常数，反映物质对光的吸收能力。以牛血清白蛋白（BSA）为例，其质量吸光系数为 0.67 μL・cm⁻¹・μg⁻¹，因此 1 μg/μL 的 BSA 溶液在 1 cm 光程下的吸光度为 0.67 OD。
比尔 - 朗伯定律的优势在于无需添加其他试剂即可定量吸光物质，但也存在以下应用限制：
比尔 - 朗伯定律的适用条件
- 分析物在特定波长下有明确的吸光特性
- 光程长度已知
- 已知分析物的摩尔吸光系数
- 缓冲液试剂的吸光度与分析物的吸光度无重叠
利用标准曲线定量
若不满足上述任一条件，可通过间接检测或绘制标准曲线的方式定量分析物。例如， Bradford 法等比色法蛋白质定量实验，依赖蛋白质存在时吸光度升高的特性，通过检测已知蛋白质浓度的标准曲线和未知样品的吸光度，即可计算未知样品的蛋白质浓度。
吸光度如何检测？
光源
顾名思义：光透射率 / 吸光度的测量首先需要光。吸光度测量可使用不同的光源，它们在覆盖的光谱范围、光强度以及发射光的稳定性方面存在差异。
卤钨灯的光谱覆盖范围为 360 nm 至 1000 nm 以上，因其成本效益高而被广泛使用。而氙闪光灯的光谱覆盖范围为 220 nm 至 1000 nm，包含紫外光谱区。这使得核酸（260 nm）和蛋白质（280 nm）的检测与定量成为可能。BMG LABTECH 吸光度酶标仪配备了用于吸光度测量的氙闪光灯，因此可最大限度地灵活测量 220 纳米到 1000 纳米之间的任何波长或整个光谱。
样品
需将目标液体转移至比色皿或微孔板中，以测量其吸光度。比色皿和微孔板的材质必须是透明的，以确保最大的光透射率，因为研究人员关注的是溶液的吸光度，而非容器材质的吸光度。不过，常用的容器材质种类多样，各有不同。聚苯乙烯是最常用的材质，可根据细胞培养或 ELISA 应用的需要进行改良，以提供特定的结合特性。但聚苯乙烯在紫外光区不透射，若要测量 400 nm 以下的吸光度，则需使用环烯烃共聚物制成的专用微孔板。
样品体积
可靠的吸光度测量需考虑的第二个方面是所需的样品体积。标准比色皿约需 4.5 毫升样品，半微量比色皿可将样品体积减少至 1.5 毫升，而微量比色皿仅需 70 微升即可进行测量。比色皿测量采用水平光路：光从一侧射入样品，在另一侧检测透射光。因此，比色皿的几何结构决定了其标准化光程为 1 厘米。这是比色皿测量与微孔板测量的主要区别之一 —— 微孔板测量采用垂直光路（从上到下或从下到上）。相应地，微孔板测量的光程也会随样品体积变化，这就要求在一次实验中使用等量的样品。此外，如操作指南《如何处理微孔板中的光程和弯月面问题》中详细说明的那样，弯月面效应在微孔板吸光度测量中对光程影响显著。在微孔板孔的中部进行测量时，若存在明显弯月面，其光程会比无弯月面时短得多。这一点在应用比尔 - 朗伯定律（Beer-Lambert）或实验中弯月面变化较大的情况下尤为重要。在水溶液中，可利用水的吸光度来校正由弯月面引起的光程变化（水峰光程校正法）。
标准 96 孔板的样品体积范围通常为 100-300 微升，对应的光程约为 2.9-7.4 毫米。对于珍贵样品，可能需要在不影响光程的前提下进一步减少用量。为此，可使用半面积板或更高密度的微孔板。这类板的孔面积更小，但高度与标准 96 孔板相同，因此能以更少的样品体积获得更长的光程。
空白样品
为校正缓冲液成分、微孔板材质及光散射带来的非特异性吸光度，需在检测样品的同时检测空白样品。合适的空白样品应包含实验中的所有试剂，唯独不含分析物，这意味着仅用 PBS 或水作为空白样品往往不够。
需特别注意分析样品和空白样品中的颗粒：颗粒会散射光，导致到达检测器的光减少，进而使测得的吸光度值偏高；且颗粒在溶液中会移动，遮挡光路时被检测，离开光路时则不被检测，这会增加吸光度数据的变异性。若无法从溶液中去除颗粒，建议在吸光度检测时覆盖更大的孔检测面积 ，BMG LABTECH 的所有设备均具备此功能。
吸光度检测器
透射光穿过样品后，需要通过检测器进行检测。酶标仪中常用的检测器主要有两种类型：光电倍增管（PMT）和 CCD 光谱仪。
基于光电倍增管（PMT）的系统需在检测前选定波长。这一过程可通过光学滤光片或光栅完成。它们先筛选出目标波长的光，再将其引导至样品。随后，目标波长的透射光到达光电倍增管，光电倍增管会放大透射光产生的信号，并输出一个与光强度相对应的电压值。若要在一定波长范围内扫描吸光度，基于光电倍增管的系统会使用光栅，为光谱中的每个测量点筛选出对应的目标波长，并依次进行测量。
这一点是其与第二种吸光度检测器 —— 光谱仪的主要区别。光谱仪会将透射光分解为不同波长的光，然后将这些光引导至 CCD 检测器，同时捕捉所有波长的光强度。通过这种方式获取单个或少数几个波长的光谱数据所需时间几乎相同。例如，BMG LABTECH 仪器采用紫外/可见光谱仪进行吸光度测量，可在不到一秒的时间内捕捉整个光谱（220-1000 nm）。
