PHERAstar FSX
功能强大，高度灵敏的HTS酶标仪
什么是吸光度？
吸光度（Absorbance）描述的是光与物质相互作用过程中，光被样品吸收的程度。当光照射到物质上时，光与分子发生相互作用，其中一部分光被吸收，其能量用于激发分子电子跃迁，并最终以热能或化学能形式释放；另一部分光则被透射或散射。
从宏观角度看，吸光度现象广泛存在于自然界。例如，植物呈现绿色，是由于叶绿素分子选择性吸收蓝光和红光，而反射绿光所致。这一现象本质上反映了物质对不同波长光的选择性吸收特性。
吸光度检测的理论基础
比色皿与微孔板中的检测路径
传统吸光度检测通常在比色皿中进行。将含有目标分析物的溶液置于比色皿中，仪器向样品发射已知强度的入射光（I_in），并在样品另一侧检测透射光强（I_out）。
在光通过样品的过程中，一部分光被分析物吸收，另一部分则可能因颗粒或溶液不均一性发生散射，从而无法到达检测器。为获得准确的吸光度信号，需通过测量合适的空白样品（blank）来校正背景吸收与散射贡献，并从总信号中扣除，以得到目标分析物的真实吸光度值。
吸光度检测结果 —— 透射率、吸光度与光密度
能够穿过样品的光占入射光的比例称为透射率（Transmission），通常以百分比表示（图 2）。溶液中分析物含量越高，光被吸收得越多，透射率相应降低。
吸光度（Absorbance）用于表征样品对光的吸收程度，其定义为透射率以 10 为底的负对数¹。
以下为描述透射率与吸光度关系的数学公式及示例：
透射率：T =Iout /Iin
吸光度：A =-log10T
表 1：透射率与对应吸光度值示例表
| 透射率 | 吸光度 |
| 0.1 （或 10%） | 1 OD （光密度单位） |
| 0.01（或 1%） | 2 OD |
| 0.001（或 0.1%） | 3 OD |
化学与生命科学中的吸光度检测 —— 定量溶液中的物质
吸光度检测的结果通常以透射率或光密度（OD）表示。其核心目的在于对溶液中目标物质进行定量分析。因此，关键在于将检测信号准确转换为浓度信息。
常用方法主要包括两类：一是基于比尔–朗伯定律（Beer–Lambert Law）进行直接计算，二是通过构建标准曲线对未知浓度样品进行定量分析。
比尔 - 朗伯定律
比尔 - 朗伯定律描述了吸光度、光程长度与吸光物质浓度之间的关系：
A = c × d × ε
变形为浓度计算公式： c = A / (d × ε)
其中：
•A = 吸光度；
•c = 物质浓度（单位根据检测需求而定，如 mol/L、μg/mL）；
•d = 光程长度（单位：cm）；
•ε = 摩尔吸光系数（与物质及波长相关，单位：L/(mol・cm) 或 mL/(μg・cm)）。
该定律表明，吸光度与 “浓度 × 光程长度 × 摩尔吸光系数” 呈线性关系 ²。光程长度指光在样品中传播的有效路径长度，例如标准比色皿的光程通常为 1 cm；摩尔吸光系数是特定物质在特定波长（通常为该物质的最大吸收波长）下的特征常数，反映物质对光的吸收能力。以牛血清白蛋白（BSA）为例，其质量吸光系数为 0.67 μL・cm⁻¹・μg⁻¹，因此在 1 cm 光程条件下，浓度为 1 μg/μL 的 BSA 溶液的吸光度为 0.67 OD。
比尔 - 朗伯定律的优势在于无需额外引入显色试剂即可实现对吸光物质的直接定量，但在实际应用中需满足以下前提条件：
- 分析物在所选波长下具有明确且稳定的吸光特性
- 光程长度已知且可重复
- 已知分析物的摩尔吸光系数
- 缓冲体系及其他组分在该波长下的吸收不干扰目标信号
利用标准曲线定量
若不满足上述条件，可通过间接检测或构建标准曲线的方法对分析物进行定量。例如，Bradford 法等比色法蛋白质定量实验，基于蛋白质存在时吸光度增强的特性，通过测定已知浓度标准样品建立标准曲线，并结合未知样品的吸光度信号，实现其浓度的定量计算。
吸光度如何检测？
光源
透射率 / 吸光度的测量首先依赖于稳定的光源。不同类型的光源在光谱覆盖范围、光强以及发射稳定性等方面存在差异，从而影响检测性能与适用范围。
卤钨灯的光谱覆盖范围为 360 nm 至 1000 nm 以上，因其效益高而被广泛应用于常规检测。相比之下， 氙闪光灯的光谱覆盖范围为 220 nm 至 1000 nm，包含紫外光谱区。从而支持核酸（260 nm）和蛋白质（280 nm）的检测与定量。BMG LABTECH 吸光度酶标仪采用氙闪光灯作为光源，可在 220–1000 nm 范围内实现任意波长选择或全光谱快速测量，显著提升检测的灵活性与效率。
样品
目标样品通常需转移至比色皿或微孔板中进行吸光度测量。所用容器材料必须具备优良的光学透过性能，以保证入射光在通过样品时的损失最小化，从而确保测得信号主要来源于溶液本身的吸光特性，而非容器材料的光学干扰。
常见微孔板及比色皿材料具有不同的光学特性与应用适配性。其中，聚苯乙烯是最常用的微孔板材料，可根据细胞培养或 ELISA 等应用需求进行表面修饰，以提供特定的生物分子结合性能。然而，该材料在紫外波段不具备光学透过性，因此当检测波长低于 400 nm 时，必须采用紫外透过材料（如环烯烃共聚物，COC）制成的专用微孔板。
样品体积
在吸光度测量中，样品体积是影响检测可靠性与数据可比性的关键参数之一。标准比色皿通常需要约 4.5 mL 样品，半微量比色皿可将体积需求降低至约 1.5 mL，而微量比色皿仅需约 70 µL 即可完成测量。
比色皿检测采用水平光路设计，即入射光沿固定光程（通常为 1 cm）穿过样品，并在对侧进行透射光检测。因此，其光程由比色皿几何结构严格定义，具有高度一致性。这一特性与微孔板检测形成本质区别：微孔板采用垂直光路（top or bottom reading），其有效光程依赖于样品体积及液面形态。
因此，在微孔板体系中，光程并非固定参数，而是随样品体积变化而变化，这要求实验设计中必须保证各孔体积一致，以维持数据的可比性。此外，如相关应用指南《如何处理微孔板中的光程和弯月面问题》 所述，液体弯月面会进一步改变实际光程，使中心测量区域的有效光程低于理想平面液面条件。该效应在基于比尔–朗伯定律的定量分析或体积波动较大的实验中尤为关键。对于水溶液体系，可通过水峰光程校正（water-peak correction）对由弯月面引起的光程偏差进行补偿。
在标准 96 孔板中，样品体积通常为 100–300 µL，对应光程约为 2.9–7.4 mm。对于样品量受限的实验体系，可采用半面积孔板或高密度微孔板，在保持孔高度不变的情况下减少孔径面积，从而在降低样品消耗的同时维持足够的光程条件
相应地，微孔板测量的光程也会随样品体积变化，这就要求在一次实验中使用等量的样品。此外，如操作指南《如何处理微孔板中的光程和弯月面问题》中详细说明的那样，弯月面效应在微孔板吸光度测量中对光程影响显著。在微孔板孔的中部进行测量时，若存在明显弯月面，其光程会比无弯月面时短。这一点在应用比尔 - 朗伯定律（Beer-Lambert）或实验中弯月面变化较大的情况下尤为重要。在水溶液中，可利用水的吸光度来校正由弯月面引起的光程变化（水峰光程校正法）。
空白对照样品
为校正缓冲体系成分、微孔板材料以及光散射等因素引入的非特异性吸光度信号，需在进行样品检测的同时设置空白对照（blank）。理想的空白样品应包含实验体系中的全部组分，仅不含目标分析物，因此在多数情况下，仅使用 PBS 或纯水作为空白对照往往不足以实现准确校正。
需特别关注样品及空白体系中的颗粒性干扰物：颗粒会引起光散射，从而降低到达检测器的透射光强，导致表观吸光度升高。此外，颗粒在溶液中的随机运动可能造成光路遮挡的时间依赖性变化，使其在检测路径中的出现呈现非稳定性，从而增加吸光度测量结果的变异性。
当体系中难以完全去除颗粒时，建议采用更大面积的孔区域进行信号采集，以降低局部不均一性对结果的影响。BMG LABTECH 全系列酶标仪均支持基于孔内多区域扫描的检测模式，可有效提升含颗粒样品吸光度测量的稳定性与重复性。
吸光度检测器
透射光穿过样品后，需要通过检测器进行检测。酶标仪中常用的吸光度检测器主要包括两类：光电倍增管（Photomultiplier Tube, PMT）与 CCD 光谱检测器（基于 CCD 的分光系统）。
基于光电倍增管（PMT）的检测系统通常需要在测量前预先选择目标波长。该过程可通过光学滤光片或单色器（光栅系统）实现，即首先对入射光进行波长筛选，再将特定波长的光引导至样品或检测路径。样品透射光随后到达光电倍增管，PMT 将光信号进行多级放大，并输出与光强度成比例的电信号（电压信号）。当需要在一定波长范围内进行扫描测量时，基于 PMT 的系统通常采用光栅逐波长扫描方式，对光谱范围内的各个离散波长逐点进行选择与检测，从而构建完整的吸光度谱图。
这一机制也是其与第二类检测系统——光谱仪的关键区别所在。基于 CCD 的光谱检测系统会将透射光通过光栅或分光元件分解为不同波长成分，并将整个光谱范围内的光同时投射至 CCD 检测器，实现多波长同步采集。由于无需逐点扫描，其获取单波长或多波长数据所需时间几乎相同。
BMG LABTECH 吸光度检测系统采用紫外/可见光光谱检测技术，可在不到 1 秒的时间内完成 220–1000 nm 全光谱吸光度数据的采集，实现高通量与高分辨率的同步测量。
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