PHERAstar FSX
Powerful and most sensitive HTS plate reader
什么是发光？
“发光（Luminescence）” 一词由 “lumin”（拉丁语，意为 “光”）与后缀 “-escence”（用于表示过程或变化）构成，本质是一种光释放过程。根据定义，发光来源于 “冷光源”，与炽热光源（如灼热的金属、燃烧的蜡烛）产生的白炽发光（incandescence）有明确区别 ¹。发光信号可通过多种能量来源的转化产生，该过程能将不可见能量转化为可见辐射，在自然界中可作为防御机制（如某些生物的发光），在技术领域可用于屏幕 LED 显示，也可用于分析检测。本文内容聚焦发光技术在生命科学领域的应用，解释其物理原理，介绍发光酶标仪的检测方式，并列举常见的发光微孔板实验。电致发光、放射发光和热致发光与本文主题无关，故不纳入讨论范围。
发光的物理原理
发光是通过能量转化产生发光信号的过程。在生命科学领域，其应用主要依赖两种能量来源：化学能和光能，分别对应化学发光（chemiluminescence）和光致发光（photoluminescence）。其中，光致发光也是荧光（含磷光）的基础原理。
两种能量来源中的任意一种，其能量被分子吸收后，会使分子中的电子跃迁至更高能级（图 1）。由于高能级状态不稳定，电子会从激发态回落至基态。回落过程中，电子会以振动能、热能和光子的形式释放能量，而光子的释放即为发光现象 ²。
在生命科学领域，人们提及磷光或光致发光时，通常会简化表述为 “荧光”；而 “发光” 一词则通常特指化学发光。这种简化表述也体现在检测方式的差异上：荧光检测需要激发光源，而发光检测无需激发光源（图 2）。本文将遵循这一常用表述习惯，重点讨论化学发光，并在后续内容中统一以 “发光” 指代化学发光。
生命科学应用中的发光技术
a) 化学发光
在化学发光反应中，底物会转化为电子激发态。处于激发态的产物或中间体，其电子回落至最低能级时会释放光子，从而产生发光现象。典型案例为鲁米诺（luminol）在过氧化氢存在下的反应（图 3）：在碱性环境中，鲁米诺会以二价阴离子（Dianion）的形式与分子氧（O₂）反应，生成电子激发态的 3 - 氨基邻苯二甲酸（3-APA）；随后，3 - 氨基邻苯二甲酸分子回落至正常能量状态，并释放出光。这一简单原理也是增强化学发光和生物发光的基础，因此这两者本质上也属于化学发光反应。
b) 增强化学发光
增强化学发光是指在化学发光反应中加入了增强剂。该技术主要以鲁米诺与过氧化氢为反应体系，但氧化反应需由辣根过氧化物酶（HRP）催化。此外，增强化学发光反应中还含有对香豆酸或 4 - 碘苯硼酸等化学物质，这些物质可增强光的产生。由于酶可催化化学反应，增强化学发光可用于酶联反应，其最主要的应用场景是免疫印迹（immunoblots）：先通过分子量大小分离蛋白质，将其转移至膜上，再通过增强化学发光进行检测。膜上固定的目标蛋白质会与特异性抗体结合，随后加入偶联辣根过氧化物酶的二抗，使蛋白质 - 抗体复合物与酶连接。借助酶和增强剂的作用，仅在存在目标蛋白质的区域会产生明亮的发光信号。
基于微孔板的生物分子定量检测也采用相同原理。以发光为读数信号的酶联免疫吸附实验（ELISA）灵敏度更高，其原理正是基于增强化学发光。目标蛋白质固定在微孔板孔内，特异性抗体、偶联辣根过氧化物酶的二抗、底物与增强剂共同作用，产生的发光信号强度随蛋白质浓度的升高而增强。
c) 生物发光
生物发光存在于生命体中。该术语也涵盖两类反应：一类是利用源自生命体的酶和底物（即使在体外使用）；另一类是通过基因工程改造，以获得更优特性的酶和底物反应。生物发光在生物体内具有多种生理功能：萤火虫通过发光吸引配偶；维多利亚水母（Aequorea victoria）或深海磷虾等生物，被认为通过发光抵御生物天敌；海洋费氏弧菌（Vibrio fischeri）等细菌则会在种群密度达到特定阈值时，通过群体感应（quorum sensing）产生发光信号，从而实现种群间的信息交流与行为协同。
这些生物是如何实现发光的呢？其核心机制是：酶（荧光素酶，luciferase）催化底物（荧光素，luciferin）氧化，在此过程中释放光子。不同生物会利用不同的酶和底物，且发光反应所需的辅因子、产生的发光波长也各不相同。图 4 展示了生命科学实验中常用的三种荧光素酶反应。
d) 生物发光共振能量转移
共振能量转移（Resonance Energy Transfer）指电子激发态的供体分子向受体荧光团转移能量的过程。该过程会激发受体荧光团，使其进而释放光子。若供体的能量来源于生物发光，则该过程被称为生物发光共振能量转移（BRET）。能量转移需满足多项条件：供体分子的发射光谱需与受体荧光团的激发光谱重叠；此外，供体与受体需处于邻近位置（通常距离为 1-10 纳米），因为能量转移效率会随距离增加而降低。因此，生物发光共振能量转移常被用于检测两种生物分子的相互作用。生物发光共振能量转移的检测输出为比值BRET，即受体荧光团的发光强度与供体的发光强度之比。BRET1、BRET2 和 NanoBRET 采用不同的酶与受体荧光团组合，具体如下表 1 所示。
表 1：BRET 类型表
|
名称 |
供体荧光素酶 |
底物 |
供体发射波长 |
受体荧光团 |
受体发射波长 |
|
BRET 1 |
Renilla |
Coelenterazine |
450-500 nm |
YFP |
515-560 nm |
|
GFP |
510-540 nm |
||||
|
BRET 2 |
Renilla |
DeepBlueC |
400-450 nm |
GFP |
500-540 nm |
|
NanoBRET |
NanoLuc |
Furimazine |
420-500 nm |
NanoBRET 618 |
550-675 nm |
|
TMR |
550-600 nm |
||||
|
AlexaFluor 633 |
600-700 nm |
||||
|
Venus |
515-575 nm |
e) 闪光型发光
生命科学领域的发光实验分为闪光型（flash）和辉光型（glow）两种反应类型，二者的核心区别在于信号持续时间。闪光型实验的信号持续时间最长仅几秒，通常需从反应开始到结束全程记录闪光强度。这意味着，闪光型反应需通过加入反应启动剂来启动，因此酶标仪需配备试剂注射系统，以实现反应自动启动与信号同步记录。常用的闪光型发光实验包括双荧光素酶报告基因技术（Dual-Luciferase Reporter™ technology）和 SPARCL 实验（SPARCL assays）。
f) 辉光型发光
与闪光型发光不同，辉光型发光可产生稳定信号，持续时间最长可达数小时。这类实验无需自动加样，可在较长时间内灵活安排检测。研究人员和试剂盒供应商通常更倾向于选择辉光型实验，因其操作更简便、检测更灵活。细胞活性检测实验 CellTiterGlo® 是辉光型发光最具代表性的应用之一。
发光如何检测？
除免疫印迹中的增强化学发光检测外，发光实验通常采用微孔板（规格涵盖 6 孔至 1536 孔）作为载体，并通过酶标仪进行定量检测。本节将介绍微孔板中发光的检测原理。
发光检测的核心组件
发光检测比荧光检测或吸光度检测更简便，因为它无需激发光源。这意味着既不需要光源，也不需要筛选激发波长。发光检测所需的最基础组件为：用于收集发光信号的透镜，以及用于检测信号的检测器（图 5）。若需检测生物发光共振能量转移（BRET），则需配备波长筛选工具；部分特定检测结构中，还可能需要光导纤维。
a) 光电倍增管（PMT）
光电倍增管（PMT）是发光检测中的核心检测器。不同光电倍增管在灵敏度（可检测的最低信号）、噪声水平以及兼容的其他检测模式上存在差异。许多检测设备配备通用型光电倍增管，可同时用于发光及其他检测模式。通用型光电倍增管的优势在于占用空间小、成本低，且仍能保证较高灵敏度。通过优化光学系统，可实现极低信号的检测，例如，PHERAstar FSX 酶标仪中采用的 “自由空气光路（free-air optical path）” 与 “增强型发光光学模块（luminescence plus optic module）” 组合，便是经过优化的高性能光学系统。
专为发光检测设计的专用光电倍增管，要么噪声更低，要么采用光子计数原理。尽管两种专用光电倍增管均能检测低信号，但光子计数系统在检测高信号时存在局限性（图 6）。
b) 光导纤维
理想情况下，检测器应直接置于微孔正上方。若无法实现这一布局，则需通过光导纤维（或透镜与反光镜）将微孔中的发光信号传导至检测器。光导纤维会吸收部分发光信号，因此与 “自由空气光路” 相比，其灵敏度会有所下降。VANTAstar、CLARIOstar Plus 和 PHERAstar FSX 酶标仪均采用了自由空气光路设计。
c) 波长筛选
部分应用场景为获得最佳检测结果，仅检测特定波长的信号。这一需求可通过在光路中放置光学滤光片或光栅来实现。生物发光共振能量转移（BRET）检测必须进行波长筛选，因为同一样品会产生两种信号，为区分供体和受体荧光团产生的光，需使用两种滤光片。
在筛选型发光检测和生物发光共振能量转移检测中，传统的光栅（grating-based monochromators）因灵敏度有限，应用范围较窄。这主要是由于光栅存在散射效应，且带宽较窄。然而，采用线性可变滤光片（LVF）光栅技术可满足灵敏度需求：基于LVF光栅具有类似滤光片的透光特性，带宽可达 100 纳米，能确保足够的信号到达检测器，适用于生物发光共振能量转移（BRET）等筛选型发光检测（图 7）。
检测时间间隔、积分时间或采集时间
发光信号的持续时间通常为1秒或更长，这与在纳秒级时间内衰减的荧光信号有明显区别。因此，发光信号的检测通常会持续一段时间，时长一般在 0.1-1 秒之间。这段时间有多种表述方式：检测时间（measurement time）、积分时间（integration time）或检测间隔时间（measurement interval time）。具体时长需综合考虑信号强度、微孔板总检测时间等因素，在各因素间找到平衡。
发光检测的技巧与注意事项
酶标仪的发光检测操作相对简便，通常所需设置较少。但仍有部分与仪器相关或通用的变量，会影响检测过程与数据质量。
积分时间
如前所述，积分时间（采集时间）的设定需考虑多种因素。选择积分时间时，应重点关注以下方面：
a) 信号强度
大多数实验产生的光信号足够强，仅需 0.02-0.5 秒即可检测到信号。极少情况下，为区分发光信号的差异，需将积分时间延长至几秒。
b) 闪光型与辉光型发光
辉光型信号通常稳定，积分时间一般设为 0.1-1 秒，因此微孔板总检测时间、信号检测的时序与时长对结果影响较小。闪光型实验则不同，由于闪光型反应的信号持续时间可能就只有几秒，需完整采集从信号启动到结束的全过程。
若需了解闪光型反应的信号曲线形态及最大发射强度，需以极短的积分时间进行多次检测。例如，若某反应持续约 1 秒，可进行 50 次、每次 0.02 秒的检测，覆盖 1 秒的反应全程，从而监测信号的整个变化与衰减过程。
c) 时间分辨率
该因素仅对动力学检测有意义。若通过发光实验监测细胞水平或生化水平的反应，反应的时间进程会决定积分时间的设定。例如，在钙检测实验中，刺激后 20 秒内会出现反应信号，可通过 “每 2 秒检测 1 次，共检测 10 次” 的方式记录信号。若仅检测1个孔，可选择1-2秒的积分时间，以获得合适的时间分辨率；但如果需要对多个孔进行检测，且需保持相同的时间分辨率（如每 2 秒记录一次每个孔的信号），则需缩短积分时间，以确保能检测完所有孔，避免数据缺失。
d) 总检测时间
由于每个孔均需设置积分时间，积分时间对微孔板总检测时间的影响较大。若每个孔的积分时间仅增加 0.2 秒，96 孔板的总检测时间会增加 20 秒，384 孔板的总检测时间会增加 1 分钟以上。因此，在高密度微孔板（384 孔或 1536 孔）检测及高通量应用（如单日需检测数千块板）中，应尽量使用短积分时间。
增益
增益可视为一种放大系数，能使固定的动态范围窗口沿样品浓度曲线移动。低信号强度需设置高增益，而强信号则需设置低增益。通常，增益会调整至 “使预期信号最强的样品达到最大检测输出” 的水平。这样做是为了在信号最强值与最弱值之间获得尽可能宽的动态范围。因此，若实验中同时包含信号最强的阳性对照样品和未知样品，可基于阳性对照样品调整增益。
通过设置不同增益以实现大动态范围的能力，使一台仪器既能检测极低信号，也能检测强发光信号。
并非所有发光酶标仪都需要手动设置增益。是否需要设置，取决于检测器类型及增益调整过程的自动化程度。
现代发光酶标仪可自动完成增益调整，这不仅减轻了研究人员的操作负担，还能确保检测覆盖宽动态范围。例如，CLARIOstar® Plus 和 VANTAstar® 仪器搭载的 “动态范围扩展（Enhanced Dynamic Range）技术”，便具备自动增益调整功能。
发光检测的微孔板颜色选择
白色微孔板最适合发光检测，因为它能反射发光信号（而非吸收信号）。关于微孔板选择的更多细节，可参考《微孔板：实际应用价值》（"The microplate: utility in practice"）。
需特别注意：若同一微孔中需同时进行发光和荧光实验，则应优先选择黑色微孔板。在白色微孔板中检测荧光，会因激发光反射导致信号极不稳定、背景信号极高，使荧光检测难以进行。在黑色微孔板中检测发光，虽会缩小检测窗口，但由于背景信号大幅降低、检测结果的偏差更小，仍能获得理想的检测结果。
什么是信号串扰？如何避免？
信号串扰（Cross-Talk）指检测器非特异性地检测到 “非目标检测孔” 的发光信号，进而干扰 “实际检测孔” 信号的现象，这是仅影响发光检测的特有问题。
由于发光反应产生的光具有扩散性，它不仅会直接向上辐射，还可能扩散到邻近孔，并在检测其他孔时被检测器捕捉。这会导致信号偏差、变异度升高，整体灵敏度下降。根据反应类型和信号扩散特性，可通过多种方法解决这一问题：
对于仅持续几秒的闪光型实验，只需改变微孔板的检测顺序即可减少串扰。由于闪光信号衰减迅速，仅当相邻孔连续检测时，才会受到串扰影响；若检测顺序改为“先检测距离较远的孔，再检测相邻孔”，则因信号已衰减至无法检测的水平，串扰会大幅降低。为此，BMG LABTECH 酶标仪提供“交错读数模式（interlaced reading mode）”，该模式先检测每隔一个孔的信号，直至检测完整个微孔板，再返回检测未检测的孔。这种设计可确保先检测孔的信号在检测其相邻孔前已充分衰减。
辉光型实验的信号稳定且持续数小时，需采用其他策略消除串扰。干扰信号主要通过两种路径到达检测位点：一是从微孔板上方扩散，二是穿过微孔壁扩散（图 8）。针对这两种路径，需采取不同的解决方法：
a) 物理遮挡
“遮光孔罩（Apertures）” 可从物理方式阻挡 “从微孔上方扩散至检测器” 的干扰信号。遮光孔罩是一种黑色勺状配件，中央带有小孔，使用时需置于微孔板上方（图 8）。目标孔的信号可通过小孔到达检测器，而周围微孔的信号则被物理遮挡。BMG LABTECH 的多功能酶标仪（PHERAstar FSX、VANTAstar 和 CLARIOstar Plus）均配备了用于提升发光检测性能的遮光孔罩。
b) 数学校正
即使是白色微孔板，光也能穿过微孔的塑料壁扩散。微孔板类型对“穿壁串扰”影响显著。通常，高密度微孔板（如 1536 孔板）的壁更薄，因此穿壁的光泄漏量比低密度微孔板更多；其次，微孔形状也会影响串扰，方形孔因与相邻孔共用孔壁，穿过壁的串扰更高，而圆形孔不与相邻孔共用壁，串扰更低；此外，微孔板颜色也会影响穿过壁的串扰，颜色越深，串扰越低，灰色微孔板则在“减少串扰”与“反射信号”之间取得了平衡。
若无法通过优化微孔板类型减少串扰，可对采集到的数据进行数学校正。先确定信号向相邻孔的渗漏比例，再通过算法对数据进行校正。BMG LABTECH 的 PHERAstar FSX、VANTAstar 和 CLARIOstar Plus 酶标仪均具备 “自动检测串扰并校正” 的功能。
微孔板的自发发光
白色微孔板具有固有磷光特性，暴露于光线后，微孔板自身会发射光。这种自发发光信号会干扰检测数据，导致空白信号升高、检测窗口缩小。因此，建议在暗处准备微孔板，或在检测前将微孔板置于暗处约 15 分钟，待磷光衰减后再进行检测。
滤光片选择
滤光片主要用于生物发光共振能量转移（BRET）检测。由于发光信号通常较弱，建议使用带宽为 80-100 纳米的宽频滤光片，更宽的带宽可使更多光通过滤光片到达检测器，从而提升检测灵敏度。
发光实验 — 发光检测的应用场景
报告基因实验
报告基因实验将 “基因调控序列” 与 “报告分子的基因信息” 结合，用于研究基因表达变化或调控区域自身的修饰。需将报告基因的基因信息导入细胞。若报告基因被激活，则会转录、翻译产生相应的酶。在底物存在的情况下，酶会催化底物转化并产生光，通过检测发光信号可反映调控序列的活性。
双荧光素酶报告基因实验
双荧光素酶报告基因实验（DLR™）在系统中加入了第二种报告基因。除与“目标调控序列”偶联的报告基因外，还引入了由“管家启动子（housekeeping promoter）”调控的第二种荧光素酶作为内参对照。使用 CLARIOstar 或 VANTAstar 酶标仪及其“发光扫描功能（luminescence scanning option）”，可筛选出匹配的荧光素酶组合，例如在单一多重荧光素酶实验中同时使用多达 6 种荧光素酶。
细胞活性检测
最常用的细胞活性实验基于萤火虫荧光素酶，其活性随 ATP 水平升高而增强，发光信号强度也随之升高。活细胞会产生 ATP，细胞裂解后释放的 ATP 为荧光素酶反应提供能量，因此发光信号强度与细胞数量及活性正相关。
除基于 ATP 的终点法细胞活性实验外，发光实验也可实时监测细胞活性。向细胞培养体系中加入“前体底物（pro-substrate）”和萤火虫荧光素酶，前体底物仅能被活细胞还原，随后被荧光素酶催化发生发光反应。通过实时监测发光信号，可反映细胞活性的动态变化。关于这类实验的更多信息，可参考《实时细胞健康实验：以更少操作获得更优数据》（"Real-time cell health assays deliver better data with less effort"）。
在药物研发中，细胞活性实验也常用于研究“蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）”和“分子胶（molecular glues）”介导的靶向蛋白降解，包括基于 “已知降解子（degrons）与连接酶（ligases）特异性相互作用” 的靶向蛋白降解研究。
代谢检测
细胞代谢涵盖分子转化的多个步骤，目前已有多种用于检测细胞代谢通路的实验采用发光技术。基础代谢研究聚焦于葡萄糖等主要营养物质的利用。例如，可通过“葡萄糖 - Glo 实验（glucose glo assay）”追踪葡萄糖消耗；也可通过检测葡萄糖的分解产物（乳酸）间接反映葡萄糖消耗，相关实验为“乳酸 - Glo 实验（lactate glo assay）”。这两种实验的性能验证可参考应用说明《基于细胞的实验中，葡萄糖实验与乳酸实验可精准监测细胞葡萄糖代谢》（"Glucose assay and lactate assay allow to monitor cellular glucose metabolism precisely in a cell-based assay"）。此外，应用说明《基于细胞的 Promega ROS-Glo™实验：发光法检测活性氧》（"ROS detection in a cell-based format using the Promega ROS-Glo™ assay"）展示了如何通过发光实验检测过量产生的活性氧（ROS）。
受体结合检测
受体是常见的药物靶点，其配体可能成为潜在治疗药物。可基于生物发光共振能量转移（BRET）原理，通过细胞实验研究配体与受体的结合。将荧光素酶在受体的胞外区域表达，配体则标记上合适的受体荧光团。若配体与受体结合，供体（荧光素酶）与受体（荧光团）会达到足够近的距离，发生能量转移，BRET比值升高。
该方法还可用于研究未标记化合物与受体的结合。未标记化合物可与“已知荧光标记配体”竞争结合受体，在这种竞争性实验中，若 BRET比值降低，表明未标记化合物取代了受体荧光团，导致能量转移中断（图 9）。
关于这类实验如何助力受体药理学研究，可参考我们的学术讲座《受体药理学的实时分析》（"Real-time profiling of receptor pharmacology"）。
