PHERAstar FSX
Powerful and most sensitive HTS plate reader
什么是发光？
luminescence 一词由 "lumin"（拉丁语，意为光）和后缀"-excence"（用于过程或变化）组成。因此，它是一个释放光的过程。根据定义，发光源于冷源，有别于热源（炽热）的发射，例如热铁或燃烧的蜡烛1。发光信号可在多种能源的能量转换过程中产生。这一过程可将不可见能量转化为可见辐射，在自然界中可用作防御机制、屏幕上的发光二极管或分析用途。本页内容主要介绍生命科学中发光方法的使用，解释其物理背景，提供在发光微孔板阅读器上检测发光的信息，并介绍常见的发光微孔板检测方法。电致发光、放射发光和热致发光与本主题无关，因此不在本内容之列。
发光的物理背景
发光是指通过能量转换产生发光信号。它在生命科学中的应用主要依赖于两种能量来源：化学能或光能，分别导致化学发光和光致发光。后者也是荧光（磷光）的基础。
两种能量源之一的能量被分子吸收，并将其电子带到一个更高的能级（图 1）。由于该能级不稳定，电子会从激发态回落到基态。回落时，电子以振动能、热量和光子的形式释放能量。后者就是发光发射2。
在生命科学中，"荧光 "通常用于磷光或光致发光，而 "发光 "通常指化学发光。这种简化得到了检测差异的支持：荧光需要激发光源，而发光则不需要（图 2）。本内容遵循这一通用术语，集中讨论化学发光，以下简称 "发光"。
生命科学中的发光应用
a) 化学发光
在这种反应中，底物在电子激发态下发生反应。激发产物或中间产物的电子通过发射光子进入最低能量状态，从而发光。一个典型的例子是发光酚在过氧化氢存在下的反应（图 3）。在碱性环境中，这种底物以一种与分子氧 O2 发生反应的形式（Dianion）存在。氧化后的中间体与电子激发的 3-氨基邻苯二甲酸（3-APA）发生反应。然后，分子降回到它通常占据的能量状态，并释放出光。这一简单的原理也是增强化学发光和生物发光的基础。因此，两者也都是化学发光反应。
b) 增强化学发光（ECL）
ECL 在化学发光反应中使用增强剂。ECL 主要使用发光酚和过氧化氢。不过，氧化是由一种酶催化的：辣根过氧化物酶（HRP）。此外，ECL 反应还含有增强光产生的化学物质，如对香豆酸或 4-碘苯硼酸。使用酶催化化学反应可使 ECL 用于酶联反应。它的主要应用是免疫印迹：蛋白质按大小分离，转移到膜上，然后用 ECL 检测。固定在膜上的相关蛋白质与蛋白质特异性抗体结合。第二种辣根过氧化物酶偶联抗体用于将蛋白质抗体与酶连接起来。由于酶和增强剂的作用，只有在发现蛋白质的地方才会产生明亮的信号。
基于微孔板的生物大分子定量也采用了同样的原理。 采用发光读数的ELISA 检测法 灵敏度更高，以 ECL 为基础。相关蛋白质被固定在微孔板孔上，特异性抗体、HRP 偶联二抗、底物和增强剂产生发光信号，该信号随蛋白质浓度的增加而增加。
c) 生物发光
生物发光发生在生物体内。该术语还包括使用酶和底物的反应，这些酶和底物最初来源于生物体，但在生物体外使用，或经生物工程改良以提供更好的特性。生物发光用于不同的生物学目的。萤火虫利用其发光能力吸引配偶。海蜇（如 Aequorea victoria）或深海虾被认为利用发光来抵御生物敌人。在 法定人数感应过程中 ， ，如海洋弧菌（Vibrio fischeri）在达到一定密度时会产生发光信号。这使得细菌群能够进行交流和协调。
这些生物是如何发光的呢？通过一种酶（荧光素酶）催化底物（荧光素）的氧化，从而释放光子。不同的生物利用不同的酶和底物。此外，发光反应需要不同的辅助因子，并产生不同的波长。图 4 显示了生命科学检测中广泛使用的荧光素酶的三种反应。
d) 生物发光共振能量转移（BRET）
共振能量转移描述了从电子激发的供体分子到受体荧光团的能量转移。这一过程会激发受体荧光团，进而发射光子。如果供体能量是由生物发光产生的，则该过程称为生物发光共振能量转移（BRET）。能量转移必须满足多种条件：供体分子的发射光谱必须与受体荧光团的激发光谱重叠。此外，供体和受体需要靠近（通常为 1-10 nm），因为随着距离的增加，转移量会减少。因此，BRET 通常用于测量两种生物分子的相互作用。BRET 的输出结果是受体荧光团的强度与供体荧光团强度的比值，即 BRET 比值。如表 1 所示，BRET1、BRET2 和NanoBRET使用不同的酶和受体荧光团组合。
表 1 - BRET 的类型
| 名称 | 供体荧光素酶 | 底物 | 供体发射 | 受体荧光团 | 受体发射 |
| BRET 1 |
雷尼拉 |
腔肠素 |
450-500 纳米 |
YFP | 515-560 纳米 |
| GFP |
510-540 纳米 | ||||
| BRET 2 | 雷尼拉 | 深蓝C | 400-450 纳米 | GFP | 500-540 纳米 |
| NanoBRET | 纳米荧光 | 呋喃嗪 | 420-500 纳米 | NanoBRET 618 | 550-675 纳米 |
| TMR | 550-600 纳米 | ||||
| AlexaFluor 633 | 600-700 纳米 | ||||
| 金星 | 515-575 纳米 |
e) 闪光发光
生命科学应用中基于发光的检测要么使用闪光反应，要么使用辉光反应。两者的区别在于信号的持续时间。闪光检测产生的信号最多持续几秒钟。产生的闪光强度通常从反应开始到结束直接记录。这意味着闪光反应需要通过添加反应启动器来启动。在微孔板阅读器上， 需要使用试剂注入 器来自动启动反应并同时记录信号。流行的闪烁发光检测法是Dual-Luciferase Reporter™ 技术或SPARCL 检测法。
f) 辉光发光
与闪烁发光不同，辉光发光可产生长达数小时的稳定信号。这种检测方法不需要自动点样，可在更长的时间跨度内读取。研究人员和试剂盒供应商往往更青睐辉光检测法，因为它们更易于处理和检测。活力检测CellTiterGlo® 就是辉光检测法的杰出代表之一。
如何检测发光？
除了西部印迹中的 ECL 检测外，发光检测通常使用微孔板（6 孔至 1536 孔格式），并使用微孔板阅读器进行定量。本节将介绍如何在微孔板中测量发光。
发光检测组件
发光比荧光或吸光更容易检测，因为无需激发。这意味着既不需要光源，也不需要选择激发波长。所需的最少组件是收集发光信号的透镜和检测器（图 5）。测量 BRET 需要波长选择工具，特定的检测结构可能需要导光板。
a) 光电倍增管（PMT）
光电倍增管（PMT）是发光检测中的探测器。PMT 的灵敏度（最低可检测信号）、噪声和测量其他检测模式的能力各不相同。许多测量设备都配有通用 PMT，可读取发光和其他检测模式。它们的优点是尽管灵敏度高，但空间和成本要求低。优化的光学系统可以测量极低的信号。 PHERAstar FSX微孔板阅读器中的自由空气光路与发光加光学模块就是这样一种优化系统。
用于发光检测的专用 PMT 要么噪声较低，要么采用光子计数原理。虽然这两种专用 PMT 也能检测低信号，但光子计数系统在检测高信号时受到限制（图 6）。
b) 导光板
理想情况下，检测器放置在孔的正上方。如果做不到这一点，就需要将发光信号从井引导到检测器。这项工作可以通过透镜和反射镜或导光板来完成。与自由空气光路相比，导光板会吸收部分发光，从而降低灵敏度。后者可在VANTAstar、CLARIOstar Plus和PHERAstar FSX微孔板阅读器上找到。
c) 波长选择
有些应用要求只检测特定波长，以获得最佳结果。这可以通过在光路中放置滤光片或单色器来实现。BRET 测量需要选择波长，因为两个信号来自同一个样品。为了区分来自供体和受体荧光团的光，需要两个滤光片。
由于灵敏度有限，传统的光栅单色器在滤光发光和 BRET 测量中处于次要地位。这是散射效应和带宽狭窄造成的。然而，使用 线性可变滤光片（LVF）的单色仪技术 可以提供所需的灵敏度。基于 LVF 的单色仪具有类似滤波器的传输性能，带宽可达 100 nm。这样就能确保有足够的信号到达探测器，用于 BRET 等滤波发光（图 7）。
测量时间间隔、积分时间或采集时间
发光信号持续时间为一秒或更长，因此与以纳秒为单位衰减的荧光明显不同。因此，检测信号的时间通常在 0.1-1 秒之间。这段时间有不同的名称：测量时间、积分时间和测量间隔时间。它取决于必须相互平衡的几个方面，如信号强度和读取平板的总时间。
发光测量的技巧、窍门和注意事项
微孔板阅读器中的发光检测相对简单，因为它通常只需要较少的设置。不过，与仪器相关的一般变量也会影响测量结果和数据质量。
积分时间
如上所述，采集时间取决于多个因素。选择积分时间时应考虑以下几个方面：
a) 信号强度
大多数检测方法发出的光足以在半秒至 0.02 秒内检测到信号。只有在极少数情况下，才有必要将积分时间延长至几秒，以检测发光信号的差异。
b) 闪光和辉光发光
辉光信号的采集时间通常为 0.1 - 1 秒，因为它们会发出稳定的信号。因此，总的平板读取时间以及信号测量的时间和持续时间作用不大。闪光检测则不同。在这种情况下，收集从开始到结束的完整发射信号非常重要，根据检测方法的不同，这可能需要几秒钟的时间。
如果想知道信号曲线的样子以及闪光反应的最大发射量，就必须在很短的积分时间内进行多次测量。例如，如果一个反应大约需要 1 秒钟，那么可以进行 50 次 0.02 秒的测量，以覆盖 1 秒钟的时间，并监测信号的发展和衰减情况。
c) 时间分辨率
这一点只适用于动力学测量。如果使用发光检测法监测细胞或生化反应，则反应的时间过程决定了积分时间。例如，在的钙测定中， 反应在 刺激后 20 秒内发生，可以通过每 2 秒测量 10 次来显示。如果只测量一个孔，则可选择 1 或 2 秒的积分时间，从而获得适当的时间分辨率。但是，如果需要以相同的时间分辨率（每 2 秒钟对每个孔进行一次测量）读取更多的孔，则需要缩短积分时间，以测量剩余的孔，避免数据丢失。
d) 总读取时间
由于积分时间应用于每个孔，因此在很大程度上会影响平板的总读取时间。每孔的积分时间只增加 0.2 秒，96 孔板的总读取时间就会增加 20 秒，384 孔板的总读取时间就会增加 1 分钟以上。因此，在高密度板（384 或 1536 孔板）和一天内需要测量数千个板的高通量应用中，使用低积分时间非常重要。
增益
增益可视为一个放大系数，它使一个固定的动态范围窗口沿样品浓度曲线移动。信号强度低需要较高的增益，而信号强度高则需要较低的增益。通常，增益的设置是为了在预期强度最高的样品上获得最大的测量输出。这样做是为了在最高测量值和最低测量值之间有尽可能大的动态窗口。因此，如果在使用未知样本的同时还使用了具有最大信号的正对照，则可对其进行增益调整。
使用不同的增益进行测量可以获得较大的动态范围，因此只需一台仪器即可测量极低的信号和明亮的发射。
并非所有发光微孔板阅读器都需要增益设置，这取决于检测器和增益调节过程的自动化程度。
现代发光微孔板阅读器可自动完成增益调整。这不仅免除了研究人员的这一责任，而且还确保了测量的宽动态范围。这类仪器有CLARIOstar® Plus和采用增强动态范围技术的VANTAstar®。
用于发光测量的平板颜色
白板最适合用于发光检测，因为它能反射信号而不是吸收信号。有关微孔板选择的更多详情，请参阅我们的博文："微孔板：实际应用"。
重要的是，如果在同一孔中同时进行发光和荧光检测，最好使用黑色微孔板。由于激发光的反射，在白色板中测量的荧光值非常不稳定，背景信号也非常高。这使得在白板中进行荧光检测很成问题。在黑板中测量荧光可以缩小检测窗口。不过，由于背景信号大大降低，测量结果的偏差也较小，因此测量结果仍会令人满意。
什么是串扰，如何避免？
串扰是指来自除被测井以外的其他井的光被检测器非特异性地测量，并改变了实际被测井的信号。这是一种只影响发光检测的现象。
由于在发光反应中产生的光是漫射的，因此它不仅会直接照射到被测井的上方，而且还会杂散到邻近的井中，并直接照射到检测位置，即使测量的是另一个井。这将导致信号偏差、更大的变化和更低的总体灵敏度。根据反应类型和信号的扩散情况，可以通过不同的方法来解决这个问题。
对于仅闪烁几秒钟的闪烁检测，只需按不同顺序测量平板即可。由于信号衰减很快，受串扰影响的只有相邻的孔，即直接相继测量的孔。如果测量的是远处的孔而不是相邻的孔，则串扰会大大减少，因为在远处检测不到衰减的信号。为此，BMG LABTECH 微孔板阅读器提供了交错阅读模式。该模式每隔一个孔测量一次，直到到达板的末端。然后再对省略区进行测量。这样，先测量的信号就会衰减，直到测量其直接相邻的信号为止。
辉光测试发出的稳定信号可持续数小时，因此需要采取其他策略来消除串扰。非预期信号可通过两种方式到达检测点：平板上方和穿过孔壁（图 8）。这两种方式都需要区别对待。
a) 物理阻断
光圈可以物理阻挡从孔上方照射到检测器的杂散光。光圈是一个黑色的勺状配件，上面有一个孔，放置在微孔板上方（图 8）。通过小孔，相关孔的信号可以到达检测器，而来自其周围的所有光线都被物理阻挡。BMG LABTECH 的多模式微孔板阅读器 PHERAstar®FSX 以及VANTAstar® 和CLARIOstar®Plus 都带有光孔，可改善发光检测。
b) 减少数学串扰
即使在白色微孔板中，光线也会透过孔的塑料壁。微孔板的类型对透过孔壁的串扰有很大影响。一般来说，高密度微孔板（如 1536 孔）比低密度微孔板的孔壁更薄，因此透过孔壁的漏光率更高。第二个方面是孔的几何形状：由于相邻孔共用一个孔壁，因此方形孔的穿墙透光率较高。圆形孔不共用孔壁，因此穿壁串扰较低。此外，平板的颜色也会影响穿透微孔板壁的串扰：颜色越深，串扰越低。灰色微孔板是减少串扰和信号反射的折衷方案。
如果无法进一步优化平板，则可对采集的数据进行数学串扰降低。为此，可确定邻近孔的信号渗入情况，并通过算法对数据进行校正。BMG LABTECH 的平板阅读器PHERAstar®FSX、VANTAstar® 和CLARIOstar®Plus 都具有自动测定和串扰校正功能。
来自平板的光辐射
白板具有固有磷光：在光照下，白板本身会发光。这种信号会改变数据，增加空白和减少检测窗口。因此，建议在黑暗中准备平板，或在测量前将平板置于黑暗中约 15 分钟。
选择过滤器
滤光片主要用于 BRET 测量。由于发光通常信号输出较低，建议使用带宽在 80 - 100 nm 之间的滤光片。更宽的带宽可使更多的光进入探测器，从而提高测量的灵敏度。
发光检测 - 发光检测有什么用途？
报告检测
报告基因检测利用基因调控序列与报告基因分子的遗传信息相结合，研究基因表达的变化或调控区本身的改变。报告基因的遗传信息需要导入细胞。如果报告基因具有活性，酶就会被转录和翻译。在底物存在的情况下，酶被转化，产生光，其发射可报告调控序列的活性。
双荧光素酶报告分析法
双荧光素酶报告分析（DLR™）为系统增加了第二个报告因子。除了与相关调控序列耦合的荧光素酶之外，还有一个由 "看家 "启动子控制的荧光素酶作为内部对照。使用 CLARIOstar 或 VANTAstar 及其荧光扫描选项，可以识别匹配的荧光素酶，并在单个复用荧光素酶检测中组合最多六个荧光素酶。
细胞活力
最常用的细胞活力检测方法是基于萤火虫酶。萤火虫酶的活性会随着 ATP 水平的升高而增加，发光也会随之增加。有活力的细胞会产生 ATP，细胞裂解后，ATP 会促进反应的进行。因此，发光与细胞数量和存活率相关。除了基于 ATP 的终点活力检测法，发光检测法还可以实时测量细胞活力。为此，需要向细胞培养物中添加原底物和萤火虫酶。原底物只被有活力的细胞还原，然后在发光反应中进行处理。这样，发光就能实时报告存活率的变化。您可以在我们的科学讲座 "实时细胞健康检测提供更好的数据，事半功倍"中了解有关这些检测的更多信息。细胞活力测定还与药物发现中的蛋白质定向降解中的PROteolysis TArgeting Chimeras (PROTACs)和分子粘合剂有关。这包括研究已知降解子和连接酶之间的特定相互作用引起的靶向蛋白质降解。
新陈代谢
细胞新陈代谢包括不同的分子转换步骤。许多可用来检测细胞代谢途径的检测方法都是以发光为基础的。基础代谢的重点是葡萄糖等主要营养物质的使用。葡萄糖消耗量可通过葡萄糖球测定法等方法跟踪。为了间接测量葡萄糖的消耗量，还可以用乳酸球测定法检测葡萄糖的分解产物--乳酸。这两种检测方法的性能在应用说明：葡萄糖检测法和乳酸盐检测法中均有展示，可在基于细胞的检测中精确监测细胞的葡萄糖代谢。在应用注释：使用 Promega ROS-Glo™ 检测法在基于细胞的格式中检测 ROS 中，展示了使用基于发光的检测法检测过量产生的活性氧。
受体结合
受体是常见的药物靶点，其配体也是可能的治疗药物。配体与受体的结合可以利用 BRET 原理在基于细胞的试验中进行研究。荧光素酶在受体的细胞外部分表达，配体与合适的受体荧光团标记。如果配体与受体结合，供体和受体就会足够接近以传递能量，BRET 比率就会增加。这种方法还能进一步研究未标记化合物与受体的结合。这些化合物可以与用荧光团标记的已知配体竞争结合。如果在这种竞争性设置中 BRET 比值降低，则说明未标记化合物取代了受体分子，导致转移损失（图 9）。
