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AlphaScreen 技术

了解 AlphaScreen 技术 —— 这是一种用于生物分子相互作用研究、筛选应用及药物研发的创新性免洗实验技术。

什么是 AlphaScreen 技术？

AlphaScreen®（全称为 “扩增发光邻近均相分析技术”，ALPHA 即 Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay）是一种基于微珠的化学技术，用于在微孔板中研究分子间的相互作用。该技术最初于 1994 年作为一种名为 LOCI®（发光氧通道免疫分析技术，Luminescent Oxygen Channeling Immunoassay）的诊断实验方法被开发出来 ¹，如今 AlphaScreen 技术（简称 Alpha 技术）已涵盖 AlphaScreen、AlphaLISA® 和 AlphaPlex™三种技术类型，主要用于生命科学领域的筛选研究。

AlphaScreen 技术的基本原理是将两种不同的目标分子与特定微珠结合：若两种分子发生相互作用，会使对应的微珠相互靠近，进而引发微珠间的能量转移，最终产生化学发光信号。该技术主要用于高通量筛选实验，可评估生物分子相互作用、底物或产物的生成 / 消耗、翻译后修饰，以及对分析物进行定量。

除相互作用实验（包括配体 / 受体、蛋白质 / 蛋白质、蛋白质 / DNA 相互作用）外，AlphaScreen 技术还可应用于 G 蛋白偶联受体（GPCR）功能实验（如第二信使检测）、酶促实验和免疫实验。

 

AlphaScreen 技术原理

AlphaScreen 实验基于两种水凝胶包被珠—— 分别称为供体珠（donor bead）和受体珠（acceptor bead）。这两种微珠含有不同的化学物质，这些物质是产生发光信号的关键。供体珠中含有光敏剂，该光敏剂在 680 nm 波长光线的激发下，会将氧气（O₂）转化为激发态的单线态氧（¹O₂）。单线态氧分子的寿命较短（半衰期为 4 微秒），在返回基态前，可在溶液中扩散约 200 纳米的距离。

若不存在受体珠，单线态氧分子会直接回到基态，不产生任何光信号；若受体珠在 200 纳米范围内，单线态氧会将能量转移给受体珠，从而产生光信号。AlphaScreen 受体珠中含有三种化学染料：噻吩（thioxene）、蒽（anthracene）和红荧烯（rubrene）。单线态氧首先与噻吩反应产生光，随后能量传递给蒽和红荧烯，最终产生波长范围为 520-620 纳米的广谱发光 ²，该信号衰减反应的半衰期为 0.3 秒。

在结合实验中，一种结合伴侣（如受体）与供体珠连接，另一种结合伴侣（如配体）与受体珠连接。当受体与配体发生相互作用时，化学能量会在两种微珠之间转移，产生发光信号（图 1）。AlphaScreen 技术也可用于竞争实验或裂解检测实验，在这类实验中，检测到的信号强度会降低。

图 1：AlphaScreen 技术基本原理示意图。左图：供体珠与受体珠未靠近，单线态氧分子衰减，无信号产生；右图：生物分子相互作用微珠靠近，单线态氧分子到达受体珠，产生 520-620 纳米范围的光信号。图中标注 “激发（680 nm）”“发射（520-620 nm）”“无相互作用”“有相互作用”

供体珠通常以链霉亲和素偶联物的形式存在，利用生物素与链霉亲和素的特异性结合来标记生物分子；而受体珠则主要与抗体偶联，因此第二种结合伙伴通常需要存在相应的抗原才能与之结合（图 2）。此外，也可通过还原胺化反应，将两种结合伴侣直接包被在微珠表面。

图 2：使用链霉亲和素包被供体珠和抗体偶联受体珠的 AlphaScreen 实验流程示意图。图中标注 “微孔板孔中的分析物”“加入生物素化抗分析物抗体和抗体偶联受体珠”“加入链霉亲和素包被供体珠（微珠靠近）”“680 nm 激发供体珠”“单线态氧激发受体珠，产生光信号"

这两种微珠的直径均在 250 纳米左右，尺寸较小，在生物缓冲液中不会沉降；同时，它们不会堵塞吸头或注射器，便于通过自动化液体处理设备操作。不过，它们的尺寸又足够大，可以通过过滤或离心进行分离。微珠表面的水凝胶涂层不仅能实现生物分子与微珠的偶联，还能减少非特异性结合和微珠自我聚集。

 

AlphaLISA 技术

AlphaLISA 是 AlphaScreen 技术的进一步发展，它与 AlphaScreen 使用相同的供体珠，但采用不同类型的受体珠。在 AlphaLISA 受体珠中，蒽和红荧烯被铕螯合物（europium chelates）替代。受激发的铕会发射波长为 615 纳米的光，且其波长带宽远窄于 AlphaScreen（图 3）。因此，AlphaLISA 的发射信号不易受化合物干扰，可用于检测生物样品（如细胞培养上清液、细胞裂解液、血清和血浆）中的分析物。

Fig. 3: Comparison of the emission spectra of AlphaScreen and AlphaLISA. Because of its narrow peak, AlphaLISA is mainly used for the detection of analytes in cell culture supernatants, cell lysates, serum and plasma.图 3：AlphaScreen 与 AlphaLISA 的发射光谱对比。由于 AlphaLISA 的发射峰较窄，其主要用于检测细胞培养上清液、细胞裂解液、血清及血浆中的分析物。

AlphaLISA 可对分泌型蛋白、细胞内蛋白或细胞膜蛋白进行定量。在生物标志物检测中，AlphaLISA 主要采用夹心免疫法：生物素化抗分析物抗体与链霉亲和素供体珠结合，另一种抗分析物抗体则与 AlphaLISA 受体珠偶联。当存在分析物时，两种微珠会相互靠近；供体珠受激发后释放单线态氧，能量转移至受体珠，产生 615 纳米的光信号（图 4）。此外，AlphaLISA 也适用于竞争型免疫实验。

图 4：AlphaLISA 夹心免疫实验示意图。一种针对分析物的生物素化抗体与链霉亲和素包被的供体微珠结合，另一种针对同一分析物的抗体则直接偶联至 AlphaLISA 受体微珠。当存在分析物时，供体微珠在 680 nm 波长下被激发，会使受体微珠在 615 nm 波长下产生光发射。

与传统酶联免疫吸附法（ELISA）相比，AlphaLISA 具有更高的灵敏度、更宽的动态范围和更稳定的性能和更短的检测时间。此外，由于无需洗涤步骤（见下文），AlphaLISA很容易适配自动化高通量筛选。

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AlphaPlex 技术

AlphaPlex 是 AlphaScreen 技术的另一项拓展，通过使用不同波长的受体珠，可在单个孔中对多达三种分析物进行定量。在这些受体珠中，蒽和红荧烯被铽螯合物（用于 AlphaPlex 545）或钐螯合物（用于 AlphaPlex 645）替代。生物素化抗分析物抗体与链霉亲和素供体珠结合，相应的抗分析物抗体则与 AlphaPlex 或 AlphaLISA 受体珠偶联。当存在目标分析物时，供体珠受激发并释放单线态氧，触发不同受体珠产生化学发光信号。

每种类型的微珠会在特定波长下发光：除 AlphaLISA 微珠的发射峰为 615 纳米外，铽螯合物微珠的发射峰为 545 纳米，钐螯合物微珠的发射峰为 645 纳米（图 5）。因此，在同一实验中使用 AlphaLISA、AlphaPlex 545 和 AlphaPlex 645 三种受体珠，可实现三联实验（同时检测三种分析物）的开发 ²。

图 5：AlphaPlex 技术：链霉亲和素供体微珠与 AlphaLISA、AlphaPlex 545 及 AlphaPlex 645 受体微珠的相互作用（用于三种不同分析物） 供体微珠充当单线态氧的来源。

 

AlphaScreen 技术如何检测？

AlphaScreen 化学反应的检测主要通过酶标仪上进行。由于 AlphaScreen 是一种独立的检测模式，实验检测需要配备 AlphaScreen 检测模式的酶标仪，这类仪器通常也具备 AlphaLISA 和 AlphaPlex 的检测能力。鉴于该技术常用于高通量药物筛选，还需兼容 384 孔和 1536 孔微孔板。

AlphaScreen 酶标仪的基本组成包括：光源、用于波长筛选的激发滤光片和发射滤光片，以及光电倍增管（PMT）检测器。

 

光源：氙灯或激光器

由于供体珠上的光敏剂需在 680 纳米波长下特异性激发，因此光源通常采用氙闪光灯或专用激发激光器。专用 AlphaScreen 激光器能将更多能量聚焦在 680 纳米波长处，性能优于氙灯，可获得动态范围更广、信噪比更高的更好结果。

专用 AlphaScreen 激发激光器常见于高端多功能酶标仪及高通量筛选（HTS）专用酶标仪，如 PHERAstar FSX 和 CLARIOstar Plus；而经济型酶标仪通常配备的是氙闪光灯，也可用于 AlphaScreen 检测。

AlphaPlex 技术需要检测不同波长的发射光：虽然可以按顺序进行测量，但同时检测两种发射光（同时双发射检测）能兼顾数据质量和检测速度，尤其适用于筛选实验。因此，同时双发射（Simultaneous Dual Emission）检测技术有助于提高 双发射AlphaLISA-AlphaPlex检测的通量。

 

信号串扰抑制

信号串扰（Cross-talk）指检测器非特异性地检测到 “非目标检测孔” 的光信号，进而对 “目标检测孔” 的信号产生负面影响。

由于 AlphaScreen 反应在孔中产生的光是漫射光，即使检测的是其他孔，这些光也可能扩散到相邻孔并直接到达检测位点，导致信号偏差、信号变异性增加和整体灵敏度降低。

干扰光信号主要通过两种途径到达检测器：一是从微孔板上方扩散，二是穿过孔壁扩散，需针对这两种途径采取不同的解决措施（图 6）。

图 6：AlphaScreen 技术中的信号串扰类型。串扰可通过两种方式发生：光线照射到微孔板上方（左图）或穿过微孔板壁（右图）。孔径物理阻挡照射到孔上方检测器的光线。然而，穿过微孔板壁的光线不受影响，仍能到达检测器（右图）。

 

  • 物理阻挡： 遮光孔罩（Apertures）是一种黑色勺状配件，中央带有小孔。将其置于特定孔上方时，可物理阻挡从相邻孔溢出的干扰光（图 6）：目标孔的光可通过小孔到达检测器，而周围孔的光则被物理遮挡。
  • 数学校正：即使是白色不透明微孔板，光也能穿过孔的塑料壁扩散。高密度微孔板（如 1536 孔板）由于孔间距小且孔壁薄，更容易发生光泄漏；此外，相邻的方形孔因共用孔壁，其 “穿壁串扰” 程度高于圆形孔；微孔板颜色也会影响穿壁串扰 —— 颜色越深，串扰越低。若无法通过优化微孔板进一步减少串扰，可对采集到的数据进行数学校正：先确定信号向相邻孔的渗漏程度，再通过算法对发光数据进行校正。

BMG LABTECH 的 PHERAstar FSX 和 CLARIOstar Plus 酶标仪均配备了上述两种串扰抑制工具。


AlphaScreen 专用微酶标仪

AlphaScreen/AlphaLISA 检测可通过 PHERAstar FSX 和 CLARIOstar Plus 酶标仪完成。由于高强度激发光源对实验有利，CLARIOstar 和 PHERAstar FSX 均配备了专用固态激光器，可产生 680 纳米波长的高强度光。此外，PHERAstar FSX 还提供专属 AlphaPlex 光学模块，支持同时测量两种 Alpha 信号。

 

AlphaScreen 技术的优势

AlphaScreen 技术是一种均相、灵敏且可微型化的平台，特别适合高通量筛选应用，主要优势如下：

 

高信噪比

AlphaScreen 的信号产生过程是级联反应，可实现高强度信号放大，因此灵敏度高；同时，背景信号低 —— 这主要是因为激发波长处于红光范围，且波长高于发射信号，可减少生物分子组分（通常在蓝绿光范围被激发）产生的自发荧光；此外，激发与发射之间的时间延迟也能进一步消除自发荧光背景信号。

 

均相实验

AlphaScreen 属于均相反应体系：检测结合态供体 - 受体珠复合物时，无需将其与未结合组分进行物理分离即可降低背景信号，因此无需中间分离或洗涤步骤，仅通过简单的 “加样 - 读数”（add-and-read）流程即可完成实验。这一特性减少了操作步骤，比其他方法更便捷、耗时更短，尤其适合自动化支持的筛选工作，也是其在药物研发和高通量筛选领域被广泛应用的原因之一。

 

可微型化

由于灵敏度高、背景低，AlphaScreen 技术可使用 1536 孔板，且可轻松将反应体积微型化至几微升，无需改变试剂浓度也不会影响实验稳定性，相关案例可参考应用说明《基于细胞的 TNF-α AlphaLISA 实验微型化》（“Miniaturization of a cell-based TNF-α AlphaLISA assay”）。

 

AlphaScreen 技术检测的注意事项

微孔板选择与操作

白色微孔板最适合 AlphaScreen 检测，因为它能反射光信号；黑色微孔板会吸收光，导致信号和背景均降低；灰色微孔板则在减少串扰和反射信号之间取得了最佳平衡。关于微孔板选择的详细信息，可参考《微孔板：实际应用价值》（"The microplate: utility in practice"）。

白色微孔板的固有磷光在暴露于阳光或室内光线后会自行发光。这种非特异性信号会与样品发射的光一起被检测到，导致空白信号和背景信号升高，实验窗口缩小。因此，建议在暗处准备白色微孔板，或在检测前将其置于暗处约 15 分钟。

 

环境光线

AlphaScreen 化学反应对光敏感，理想情况下应在弱光环境（低于 100 Lux）下准备和进行实验。若无法满足这一条件，可在密闭房间内安装绿色滤光照明 —— 工作区和 / 或酶标仪附近的灯具需覆盖绿色滤光片。研究表明，使用绿色滤光片的效果几乎与在暗处进行实验相当（图 7）。

图 7：光照时间曲线显示绿色滤光片在保护 AlphaScreen 信号稳定性方面的有效性 ³。

长时间培养的微孔板应避光--用深色布、铝箔或纸板箱遮盖。避免将微孔板或读板器暴露在阳光直射或强光下。

需长时间孵育的微孔板应避光保存，可使用深色布、铝箔或纸箱覆盖；避免微孔板或酶标仪暴露在直射阳光或强光下。

 

环境温度

AlphaScreen 化学反应对温度敏感，应避免室温剧烈波动，否则会对信号的产生、信号的强度和稳定性造成负面影响。通常，AlphaScreen 信号的变化幅度约为每摄氏度 8%³。

为避免读数时微孔板上出现信号强度梯度，试剂和微孔板均需与室温平衡。对于微孔板，可通过在 THERMOstar 培养箱中孵育轻松实现温度平衡。配备 AAS 系统（环境控制单元）的 PHERAstar FSX 甚至可将温度设定在 18-45 摄氏度之间，从而将仪器孵育腔冷却至室温或更低温度。该应用说明展示了 AAS 系统具备维持稳定温度、减少蒸发以及缩短从高温到低温的冷却时间方面的能力。

 

细胞培养基与血清

RPMI 1640、MEM、DMEM 等细胞培养基会对信号强度产生负面影响：10% 的培养基的存在就会导致约 30% 的信号淬灭；同样，10% 胎牛血清会使信号降低约 25%³。因此，建议在进行 AlphaScreen 反应前，用 PBS 等合适的缓冲液冲洗细胞样品。

 

AlphaScreen 实验应用

AlphaScreen 技术可用于 96 孔、384 孔和 1536 孔微孔板，分析不同生物背景下的结合事件或生化事件，在药物筛选领域应用尤为广泛。

AlphaScreen 技术的应用场景包括：G 蛋白偶联受体（GPCR）功能实验（如 cAMP、IP3、磷酸化 ERK1/2 检测）、酶促实验（如酪氨酸激酶、解旋酶、蛋白酶、磷酸酶实验）、相互作用实验（如细胞因子结合实验、核受体功能实验、配体 - 受体结合实验、蛋白质 / 蛋白质、蛋白质 / DNA、蛋白质 / 肽相互作用实验），以及用于分析物定量的类 ELISA 免疫实验（如 TNF-α、IgG 检测）。

 

结合实验：蛋白质 - 肽相互作用与抑制剂筛选

在应用说明《PHERAstar 通过 AlphaScreen 实验开发人源 YEATS 结构域选择性抑制剂》（PHERAstar measures AlphaScreen assay to develop selective inhibitors for the human YEATS domains）中，展示了一个基于 AlphaScreen 的相互作用实验案例。

YEATS 结构域是表观遗传调控因子，含有 YEATS 结构域的 ENL 蛋白已被证实是多种急性白血病的主要驱动因子，因此 ENL 成为药物研发靶点。为筛选 ENL 的选择性抑制剂，研究人员使用 AlphaScreen 组氨酸检测试剂盒，建立了组蛋白 3（H3）-YEATS 结构域结合实验：供体珠通过链霉亲和素与酰化 H3 偶联，受体珠与 YEATS 结构域偶联。当蛋白质与肽发生相互作用时，两种微珠相互靠近，产生 AlphaScreen 信号（图 8）；抑制剂通过破坏 H3-YEATS 相互作用，降低发射信号强度。

图 8：AlphaScreen 相互作用实验示意图。供体微珠偶联至酰化组蛋白 3，受体微珠偶联至 YEATS 结构域。

 

免疫实验：磷酸化 ERK1/2 检测

除相互作用实验外，AlphaScreen 技术也可用于免疫实验。许多 G 蛋白偶联受体（GPCR）的反应难以通过现有实验形式检测，由于 ERK 磷酸化级联反应会导致调控基因转录的胞质和核蛋白磷酸化，因此可通过检测 ERK 磷酸化来筛选GPCR 参与诱导的细胞变化。

研究人员使用 AlphaScreen SureFire® ERK1/2 磷酸化实验检测细胞裂解液：这是一种夹心免疫测定，磷酸化细胞蛋白被 “与链霉亲和素包被供体珠结合的抗分析物抗体” 和 “与蛋白 A 偶联受体珠结合的抗磷酸化抗体” 夹在中间（图 9）。分析物的磷酸化会导致光信号增强，相关细节可参考应用说明《AlphaScreen SureFire 磷酸化 ERK1/2 实验》（An AlphaScreen SureFire Phospho-ERK1/2 assay）。

图 9：AlphaScreen 免疫实验示意图。在全细胞裂解物中，一种磷酸化的细胞蛋白（分析物）被夹在两种抗体之间：一种是与链霉亲和素（SA）包被的供体微珠相连的抗分析物抗体，另一种是与蛋白 A 偶联的受体微珠相连的抗磷酸化抗体。磷酸化作用使这两种微珠相互靠近，从而产生光信号。 图中标注 “在总细胞裂解液中，磷酸化细胞蛋白（分析物）被‘与链霉亲和素（SA）包被供体珠结合的抗分析物抗体’和‘与蛋白 A 偶联受体珠结合的抗磷酸化抗体’夹在中间”“磷酸化使两种微珠靠近，产生光信号”

 

参考文献

  1. 发光氧通道免疫测定：通过化学发光测量微粒结合动力学。Ullman, EF, et al.Natl.美国国家科学院，第 91 卷，第 5426-5430 页，1994 年 6 月。
  2. Yasgar A, Jadhav A, Simeonov A, Coussens NP.AlphaScreen-Based Assays：超高通量筛选挑战性酶和蛋白质-蛋白质相互作用的小分子抑制剂。2016;1439:77-98. doi:10.1007/978-1-4939-3673-1_5
  3. https://www.urmc.rochester.edu/MediaLibraries/URMCMedia/hts/documents/AlphaScreenPracticalGuide.pdf

 

AlphaScreen、AlphaLISA、AlphaPlex 和SureFire® 是珀金埃尔默公司的注册商标。

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