PHERAstar FSX
功能强大，高度灵敏的HTS酶标仪
什么是 AlphaScreen 技术？
AlphaScreen®（Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay，扩增发光邻近均相分析技术）是一种基于供体/受体微珠体系的均相发光检测技术，广泛应用于微孔板平台中的分子相互作用分析与高通量筛选（HTS）研究。
该技术最初源自1994年开发的 LOCI®（发光氧通道免疫分析技术，Luminescent Oxygen Channeling Immunoassay），作为一种诊断实验方法 ¹。随着技术发展， 如今 AlphaScreen 技术（以下简称 Alpha 技术）Alpha 技术平台体系，主要包括 AlphaScreen、AlphaLISA® 以及 AlphaPlex™ 三大技术分支，现已广泛应用于生命科学基础研究。
AlphaScreen 技术基于供体微珠与受体微珠的邻近效应实现信号检测。当两种分别标记目标分子的微珠因分子相互作用而靠近时，供体微珠在激发后产生单态氧（¹O₂），并将能量传递至受体微珠，从而触发级联化学发光反应，产生可检测信号。信号强度与分子间相互作用程度或分析物浓度相关。该技术广泛用于高通量筛选，可用于评估生物分子相互作用、底物或产物变化、翻译后修饰及多种目标分子的定量分析。除相互作用检测（如配体–受体、蛋白质–蛋白质及蛋白质–DNA）外，还可应用于 GPCR 功能分析（第二信使检测）、酶活性测定及免疫分析等多种生物检测体系。
AlphaScreen 技术原理
AlphaScreen 实验基于两种水凝胶包被微珠体系，分别为供体珠（donor bead）与受体珠（acceptor bead）。两类微珠内部负载不同的功能性化学组分，这些组分共同构成发光信号产生的核心。
供体珠内含光敏剂，在 680 nm 激发光照射下，可将溶解氧转化为高活性单线态氧（¹O₂）。单线态氧具有较短寿命（半衰期约 4 μs），在回到基态前可在溶液中扩散约 200 nm 的距离。 当体系中不存在邻近受体珠时，单线态氧迅速弛豫至基态，不产生可检测信号；当受体珠处于约 200 nm 范围内时，单线态氧将能量转移至受体珠，引发级联化学发光反应。
受体珠内含三种染料体系：噻吩（thioxene）、蒽（anthracene）和红荧烯（rubrene）。单线态氧首先氧化噻吩生成激发态中间体，随后通过能量级联依次传递至蒽与红荧烯，最终产生波长范围为 520–620 nm 的宽谱发光信号。该发光过程具有约 0.3 s 的衰减半衰期。
在结合分析中，一种结合配体（如受体分子）通常偶联于供体珠，另一结合伴侣（如配体分子）偶联于受体珠。当两者发生特异性相互作用时，微珠被拉近至有效能量转移距离内，从而产生可检测发光信号（图 1）。此外，在竞争性或裂解型检测模式中，目标分子占据结合位点会导致微珠邻近效应降低，从而表现为信号强度下降。
供体珠通常以链霉亲和素偶联形式存在，可利用生物素–链霉亲和素之间的高亲和力特异性实现生物分子的标记与捕获；受体珠则多通过抗体偶联方式进行功能化，因此其结合伴侣通常需要携带相应抗原表位以实现特异性识别与结合（图 2）。此外，也可通过还原胺化反应等化学偶联策略，将不同结合伴侣直接固定于微珠表面，从而构建多样化检测体系。
两类微珠直径均约为 250 nm，在生物缓冲体系中可保持良好悬浮稳定性，不发生明显沉降。其粒径设计既避免了对移液吸头或注射系统的堵塞，也便于在自动化液体处理平台中进行高通量操作；另一方面，该尺寸仍足以通过过滤或离心实现有效分离与处理。微珠表面的水凝胶包被层不仅为生物分子的共价或非共价偶联提供了功能界面，同时可有效降低非特异性吸附与微珠间自聚集，从而提升检测体系的稳定性与信噪比。
AlphaLISA 技术
AlphaLISA 是 AlphaScreen 技术的衍生与优化版本，两者共享相同的供体珠体系，但在受体珠设计与信号产生机制上存在本质差异。在 AlphaLISA 中，受体珠内的有机发光体系（蒽与红荧烯）被铕螯合物（europium chelate）所替代，从而实现由化学发光向时间分辨荧光检测机制的转变。
在检测过程中，铕螯合物在能量转移后被激发并产生约 615 nm 的特征窄带发射信号。相较于 AlphaScreen 的宽谱发光输出，AlphaLISA 具有显著更窄的发射带宽与更高的光谱分辨率，可有效抑制化合物自发荧光及光谱串扰干扰，因此在复杂生物样本（如细胞裂解液、培养上清、血清及血浆）中仍可获得较高信噪比与检测稳定性（图 3）
在应用层面，AlphaLISA 可用于分泌蛋白、胞内蛋白及膜蛋白的高灵敏定量分析。在典型夹心免疫分析体系中，生物素化抗体与链霉亲和素供体珠结合，另一识别抗体则偶联于 AlphaLISA 受体珠。目标抗原存在时形成“抗体–抗原–抗体”夹心结构，使供体与受体微珠发生邻近；供体珠在 680 nm 激发下产生单线态氧（¹O₂），并在邻近范围内触发铕螯合物发光，从而产生 615 nm 窄带检测信号（图 4）。此外，该体系亦可扩展至竞争性免疫检测模式，用于小分子或低分子量分析物的定量分析。
相较传统酶联免疫吸附法（ELISA） ，AlphaLISA 在灵敏度、动态范围及检测线性方面均具有显著优势，同时具备更高的实验稳定性与更短的检测周期。由于其完全均相（homogeneous）的检测特性，无需洗涤步骤，因而高度适配自动化液体处理系统及高通量筛选（HTS）平台，尤其适用于大规模样本分析与药物发现流程中的高通量定量检测需求。
AlphaPlex 技术
AlphaPlex 是 AlphaScreen 技术体系的进一步扩展版本，通过引入多种波长编码的受体珠，实现单孔多重检测（multiplexing），从而可在同一反应体系中同时对多达三种不同分析物进行定量分析。 该技术在供体珠体系上与 AlphaScreen/AlphaLISA 保持一致，而在受体珠设计上进行功能拓展：将传统的蒽与红荧烯发光体系分别替换为不同稀土螯合物，包括铽螯合物（Terbium chelate，用于 AlphaPlex 545）和钐螯合物（Samarium chelate，用于 AlphaPlex 645）。这些不同的受体体系赋予微珠特异性的发射光谱特征。 生物素化抗分析物抗体与链霉亲和素供体珠结合，相应的抗分析物抗体则与 AlphaPlex 或 AlphaLISA 受体珠偶联。当存在目标分析物时，供体珠受激发并释放单线态氧，触发不同受体珠产生化学发光信号。
不同受体珠在特定波长下产生可区分的发射信号：AlphaLISA 微珠发射峰约为 615 nm，AlphaPlex 545（铽螯合物）发射峰约为 545 nm，AlphaPlex 645（钐螯合物）发射峰约为 645 nm（图 5）。通过光谱分离与信号解卷积算法，可在同一微孔反应体系中实现三重分析物的同步检测，从而显著提升检测通量与样本利用效率，适用于多指标生物标志物分析。
如何使用AlphaScreen 技术进行检测？
AlphaScreen 化学反应的检测主要通过酶标仪上进行。由于 Alpha 技术属于独立的检测模式，实验需使用集成 AlphaScreen 检测功能的仪器平台，通常该类设备同时兼容 AlphaLISA 与 AlphaPlex 。考虑到其在高通量筛选（HTS）中的广泛应用，仪器还需支持 384 孔及 1536 孔微孔板格式，以满足高密度样本分析需求。
AlphaScreen 酶标仪的基本组成包括：光源、用于波长筛选的激发滤光片和发射滤光片，以及光电倍增管（PMT）检测器。
光源：氙灯或激光器
由于供体珠上的光敏剂需在 680 纳米波长下特异性激发，因此光源通常采用氙闪光灯或专用激发激光器。专用 AlphaScreen 激光器可在 680 nm 波段提供更高能量密度与更优的光谱匹配，从而实现更宽的动态范围及更高的信噪比。
专用激发激光器多配置于高端多功能酶标仪及高通量筛选（HTS）专用平台中，例如 PHERAstar FSX 和 CLARIOstar Plus ；而经济型酶标仪通常配备氙闪光灯，同样可支持 AlphaScreen 检测，但在灵敏度和检测性能方面相对受限。
AlphaPlex 技术需要检测不同波长的发射光：除顺序检测模式外，双发射检测（Simultaneous Dual Emission）可在不降低数据质量的前提下显著提升检测效率，尤其适用于高通量筛选场景，有助于提高 AlphaLISA–AlphaPlex 双发射检测的整体通量与数据一致性。
信号串扰抑制
信号串扰（Cross-talk）指检测器非特异性接收到来自非目标孔的发光信号，从而对目标孔读数产生干扰，表现为信号偏移、孔间变异性增加以及整体检测灵敏度下降。
在 AlphaScreen 体系中，由于反应产生的发光以漫射光形式传播，即使仪器聚焦于特定检测孔，相邻孔的光信号仍可能通过空间扩散进入检测路径，从而引入系统性误差如信号偏差、信号变异性增加和灵敏度降低。
干扰信号主要通过两种路径到达检测器：其一为经微孔板上方空间散射进入检测通道，其二为穿透或沿孔壁传播后进入相邻孔的检测区域。因此，需针对上述两类传播路径分别进行光学隔离与结构优化，以有效降低串扰效应（图 6）。
- 物理阻挡： 遮光孔罩（Apertures）是一种黑色勺状配件，中央带有小孔。将其置于特定孔上方时，可物理阻挡从相邻孔溢出的漫射干扰光（图 6）：目标孔发射光可通过中心孔进入检测路径，而周围孔的杂散光则被物理屏蔽，从而显著降低上方空间传播导致的串扰。
- 数学校正：即使采用不透明微孔板，光信号仍可能通过孔壁材料发生侧向传播。该效应在高密度微孔板（如 1536 孔板）中更为显著，主要由于孔间距减小及孔壁变薄所致；此外，共享孔壁的方形孔结构较圆形孔更易产生“穿壁串扰”。微孔板颜色同样影响串扰程度，通常颜色越深，光泄漏越低。在物理优化手段（如微孔板类型选择）无法进一步降低串扰时，可采用数学校正方法：通过实验或模型估计信号在相邻孔间的泄漏系数，进而基于算法对原始发光数据进行反卷积或矩阵校正，得出目标孔的真实信号强度。
BMG LABTECH 的 PHERAstar FSX 和 CLARIOstar Plus 酶标仪均配备了上述两种串扰抑制工具。
AlphaScreen 专用微酶标仪
AlphaScreen/AlphaLISA 检测可通过 PHERAstar FSX 和 CLARIOstar Plus 酶标仪完成。鉴于高强度、窄带激发对 Alpha 技术性能至关重要，两款仪器均配备专用固态激光光源，可在 680 nm 波长提供高能量密度激发。在功能拓展方面，PHERAstar FSX 还提供专用 AlphaPlex 光学模块，支持同时检测两种 Alpha 发射信号，在保证数据质量的同时显著提高检测通量 。
AlphaScreen 技术的优势
AlphaScreen 技术是一种均相、灵敏且可微型化的平台，特别适用于高通量筛选（HTS）应用，其核心优势体现在以下几个方面：
高信噪比
AlphaScreen 采用级联信号放大机制，可产生高强度发光信号，从而实现优异的检测灵敏度。同时，其背景信号显著降低：一方面，激发波长位于红光区域（680 nm），高于发射波段，有效避免大多数生物分子在蓝绿光区的自发荧光干扰；另一方面，通过引入激发与发射之间的时间延迟，可进一步抑制短寿命背景荧光，从而显著提升信噪比。
均相检测体系
AlphaScreen 属于典型的均相检测技术，在检测供体–受体微珠复合物时，无需将结合态与游离组分进行物理分离即可获得可靠信号。因此，实验流程无需洗涤或分离步骤，仅通过“加样–孵育–读数”（add-and-read）即可完成检测。该特性显著简化操作流程、缩短实验时间，并降低人为误差，尤其适用于自动化平台支持的高通量筛选及药物研发应用。
微量检测
得益于其高灵敏度，AlphaScreen 技术可在不降低检测性能的前提下实现反应体系的显著微量化。其兼容 1536 孔微孔板型号，反应体积可缩小至微升级别，同时无需改变试剂浓度即可保持良好的信号稳定性与重复性。 相关案例可参考应用说明《基于细胞的 TNF-α AlphaLISA 实验微型化》（“Miniaturization of a cell-based TNF-α AlphaLISA assay”）。
AlphaScreen 技术检测的注意事项
微孔板的选择与准备
白色微孔板通常为 AlphaScreen 检测的首选，因为其高反射特性有助于增强发光信号；黑色微孔板则因吸光效应会同时降低信号与背景；灰色微孔板在信号反射与串扰抑制之间提供折中方案，更适用于对串扰控制要求较高的实验体系。 关于微孔板选择的详细信息，可参考《微孔板：实际应用价值》（"The microplate: utility in practice"）。
白色微孔板在暴露于环境光（尤其是阳光或强室内光）后可能产生固有磷光，从而引入非特异性背景信号，抬高空白读数并压缩检测窗口。为降低该效应，建议在避光条件下进行微孔板准备，或在检测前将微孔板置于暗处平衡约 15 分钟。
环境光线
AlphaScreen 反应对环境光高度敏感，实验操作建议在弱光条件（<100 Lux）下进行。若无法完全避光，可采用绿色滤光照明系统，在实验区域或仪器周围加装绿色滤光片，可有效降低环境光对检测体系的干扰，其效果接近于全暗操作条件（图 7）。
环境温度
AlphaScreen 化学反应对温度较为敏感，应避免室温剧烈波动，否则会对信号的产生、信号的强度和稳定性造成负面影响。通常情况下，信号强度随温度变化约为每升高 1 °C 产生约 8% ³ 的波动。
为避免读数时微孔板上出现信号强度梯度，试剂和微孔板均需与室温平衡。微孔板可在 THERMOstar 培养箱中孵育实现温度平衡。配备 AAS 系统（环境控制单元）的 PHERAstar FSX 可在 18–45 °C 范围内精确控温，并支持快速温度切换，有助于降低蒸发效应，节省时间并提高实验重复性。
细胞培养基与血清
常用细胞培养基（如 RPMI 1640、MEM、DMEM）会对 AlphaScreen 信号产生显著淬灭效应，例如约 10%（v/v）培养基可导致约 30% 的信号降低；类似地，10% 胎牛血清（FBS）可引起约 25% 的信号衰减 ³。因此，建议在进行 AlphaScreen 反应前，用 PBS 等合适的缓冲液冲洗细胞样品。
AlphaScreen 技术应用举例
AlphaScreen 技术兼容 96 孔、384 孔及 1536 孔微孔板规格，可在多种生物体系中对分子结合及生化反应进行定量分析，尤其适用于高通量筛选（HTS）流程。
AlphaScreen 技术的应用场景包括：G 蛋白偶联受体（GPCR）功能实验（如 cAMP、IP3、磷酸化 ERK1/2 检测）、酶促实验（如酪氨酸激酶、解旋酶、蛋白酶、磷酸酶实验）、分子相互作用实验（如细胞因子结合实验、核受体功能调控、配体 - 受体结合实验、蛋白质 / 蛋白质、蛋白质 / DNA、蛋白质 / 肽相互作用实验），以及用于分析物定量的类 ELISA 免疫实验（如 TNF-α、IgG 检测）。
结合实验：蛋白质 - 肽相互作用与抑制剂筛选
在应用说明《PHERAstar 通过 AlphaScreen 实验开发人源 YEATS 结构域选择性抑制剂》（PHERAstar measures AlphaScreen assay to develop selective inhibitors for the human YEATS domains）中，我们介绍了一个基于 AlphaScreen 的相互作用实验案例。
YEATS 结构域是表观遗传调控因子，其中，含 YEATS 结构域的 ENL 蛋白已被证实在多种急性白血病中发挥驱动作用，因此 ENL 成为药物研发靶点。为筛选 ENL 的选择性抑制剂，研究人员使用 AlphaScreen 组氨酸检测试剂盒，建立了组蛋白 3（H3）-YEATS 结构域结合实验：供体珠通过链霉亲和素与酰化 H3 偶联，受体珠与 YEATS 结构域偶联。当蛋白质与肽发生相互作用时，两种微珠相互靠近，产生 AlphaScreen 信号（图 8）；抑制剂通过破坏 H3-YEATS 相互作用，从而引起信号强度下降。基于该信号变化，可实现对候选抑制剂活性及选择性的定量评估。
免疫实验：磷酸化 ERK1/2 检测
除相互作用实验外，AlphaScreen 技术同样适用于免疫检测体系。在 G 蛋白偶联受体（GPCR）信号研究中，ERK 磷酸化作为经典下游通路事件，可反映受体激活后引发的细胞内信号级联变化，因此常用于 GPCR 功能筛选与细胞响应评估。
研究人员使用 AlphaScreen SureFire® ERK1/2 磷酸化实验检测细胞裂解液进行检测：磷酸化 ERK1/2 分子被两种抗体同时识别并夹持：一抗与链霉亲和素包被供体珠结合，另一抗（磷酸化特异性抗体）则与蛋白 A 偶联受体珠结合（图 9）。当目标蛋白发生磷酸化时，两类微珠形成邻近复合物，从而产生 AlphaScreen 发光信号增强。，相关细节可参考应用说明《AlphaScreen SureFire 磷酸化 ERK1/2 实验》（An AlphaScreen SureFire Phospho-ERK1/2 assay）。
参考文献
- Ullman, E. F.; Kirakossian, H.; Singh, S.; Wu, Z. P.; Irvin, B. R.; Pease, J. S.; Switchenko, A. C.; Irvine, J. D.; Dafforn, A.; Skold, C. N.; et al., Luminescent oxygen channeling immunoassay: measurement of particle binding kinetics by chemiluminescence. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994, 91 (12), 5426-5430.
- Yasgar A, Jadhav A, Simeonov A, Coussens NP. AlphaScreen-Based Assays: Ultra-High-Throughput Screening for Small-Molecule Inhibitors of Challenging Enzymes and Protein-Protein Interactions. Methods Mol Biol. 2016;1439:77-98.
- https://www.urmc.rochester.edu/MediaLibraries/URMCMedia/hts/documents/AlphaScreenPracticalGuide.pdf
AlphaScreen、AlphaLISA、AlphaPlex 和SureFire® 是珀金埃尔默公司的注册商标。
CLARIOstar Plus
用于研发检测的高灵活度酶标仪