CLARIOstar Plus
Most flexible Plate Reader for Assay Development
什么是荧光强度？
荧光基于光致发光原理，是一种物质吸收光后再释放光的发光过程。从物理角度来说，荧光是物质吸收光能量后发射光的现象，而荧光强度则指发射光（光子）的总量，代表了荧光的发射程度，其大小取决于受激发的荧光团浓度。
荧光由被称为 “荧光团” 的荧光分子吸收能量（光）后产生，吸收的能量使分子内电子跃迁至更高能级。由于激发态不稳定，电子会回落至基态，并在此过程中发射光（图 1）。
吸收的光子中，有一小部分能量会转化为分子的运动能和热能。因此，电子回落时释放的能量始终小于激发电子所需的能量。由于长波辐射的能量低于短波辐射，发射光的波长始终长于激发光波长。激发峰与发射峰（最大值）之间的波长差被称为 “斯托克斯位移（Stokes shift）”（图 2）¹。
激发光（吸收光）波长小于发射光波长这一特性，为荧光强度的分析应用提供了可能。通过特定波长激发荧光团，并在更长波长下测量其发射强度，即可检测荧光团。荧光强度与被激发荧光团的浓度呈线性相关，因此适用于定量分析。
荧光强度在生命科学领域应用广泛：在显微镜技术中用于生物分子的定位与定量，在流式细胞术中用于细胞分析，在微孔板实验中用于分子定量、酶活性检测，甚至分子间相互作用研究。本文将聚焦微孔板实验中荧光强度的应用，包括其检测方法、检测注意事项及常见实验类型。
荧光团
荧光团（又称荧光染料，fluorochrome）是一类受光激发后可发射光的荧光化合物。目前已知的具有荧光特性的分子多达数千种 ²，它们在以下方面存在差异：
分子大小
许多荧光团是小分子化合物，易于与其他分子偶联；而绿色荧光蛋白（GFP）、红色荧光蛋白（RFP）等荧光蛋白分子量较大，可在细胞中表达。荧光蛋白可用于标记蛋白质以进行表达研究、、构建内源性表达生物传感器，或直接作为细胞定量标记物。 VANTAstar酶标仪可精准监测基于 GFP 和 mCherry 的转染效率。
激发与发射波长
荧光团的激发和发射特性以光谱形式呈现：在坐标系中，横坐标为波长（纳米），纵坐标为强度。光谱曲线经 100% 归一化处理，可快速确定最大激发波长、最大发射波长及斯托克斯位移。这些信息对选择适配实验的荧光团至关重要。 荧光团需与检测系统、潜在自发荧光，以及实验中可能使用的其他荧光团兼容。
量子产率
量子产率是衡量受激发分子将吸收的光子转化为发射光的效率指标。结合分子对光的吸收程度（消光系数），量子产率可反映荧光团的发光亮度。
FRET 对由两种荧光团组成
荧光共振能量转移（FRET，Förster´s Resonance Energy Transfer）指能量从供体荧光团转移至受体荧光团的过程。当受体被供体的发射光激发，且两种荧光团处于邻近位置时，能量转移就会发生。FRET 常用于分子结合研究或生物传感器。在生物传感器应用中，当分析物结合时，传感器会改变构象，使两种荧光团相互靠近。FRET的发生需要供体的发射光谱与受体的激发光谱存在重叠 ³（图 3）。
荧光强度检测
尽管荧光团各不相同，但微孔板中荧光强度检测的基本原理一致（图 4），具体流程如下：
- 光源产生广谱光
- 从广谱光中筛选出特定范围的激发波长
- 该激发波长范围的光激发荧光团
- 从发射光中筛选出特定范围的发射波长
- 检测器对筛选后的发射光进行定量
与吸光度不同，荧光强度检测并非绝对测量。荧光信号强度通常相对于其他测量结果，或仪器的参比测量结果，因此荧光酶标仪以“相对荧光单位（RFU）” 量化样品发射的光信号。
光源
酶标仪常用的光源有三种，无论仪器配备哪种光源，其性能都会影响检测结果。更多细节可参考操作指南《闪光次数如何影响检测结果？》（How does the number of flashes influence measurement results?）。
氙闪光灯
氙闪光灯的发光波长范围为 200 纳米至 2500 纳米，可激发从紫外到红外波段有吸收的任意分子，具有信号输出高、寿命长的优势。因此，BMG LABTECH酶标仪采用氙闪光灯作为荧光激发光源。
钨卤素灯
卤素灯的发光波长约从360纳米开始，不适合紫外荧光强度检测。与氙闪光灯相比，卤素灯寿命更短、输出强度较低，若用于酶标仪的荧光检测，灵敏度会更低。
发光二极管
发光二极管（LED）发光强度高，但仅能发射特定带宽的光。因此，检测不同激发波长需使用多个二极管，这使得多种荧光团的灵活检测更复杂、成本更高。
波长筛选
广谱激发光源可覆盖从紫外到红外的宽波长范围。为特异性激发目标荧光团并避免非特异性信号，需对广谱激发光进行筛选（过滤），仅让荧光团最大激发波长附近的光通过；同理，也需对发射光进行筛选，仅保留荧光团最大发射波长附近的光。通过这种方式，只有目标荧光团产生的荧光会被引导至检测器，优化波长范围可提升实验灵敏度。
部分荧光强度酶标仪会在激发与发射光路之间增加 “二向色镜（dichroic mirror）” 以进一步筛选光，提升检测灵敏度。二向色镜通常允许高于特定波长的光透过，阻挡低于该波长的光，其截止波长介于激发与发射波长之间，可减少激发光向检测器的泄漏。
滤光片
光学滤光片是带有光学涂层的薄圆形或矩形玻璃片，涂层仅允许特定波长的光透过。具有不同最大激发和发射波长的荧光团，需使用不同的滤光片。滤光片通常以 “中间透射波长” 命名，该波长常为荧光团的最大激发或发射波长，滤光片还具有特定的带宽（或带通），代表透光范围的宽窄。例如，中心波长 485 纳米、带宽 10 纳米的滤光片，可过滤出 480-490 纳米范围的白光。
光栅
与光学滤光片不同，光栅可根据需求筛选不同波长的光。酶标仪中使用的光栅分为两类：传统光栅（grating-based monochromators）和线性可变滤光片（linear variable filter monochromators）。
在光栅中，白光通过衍射分解为不同颜色的波长，再通过狭缝筛选波长，狭缝会物理阻挡不需要的光，仅让目标波长通过。光栅法的缺点是透光率低，且会产生杂散光，杂散光可能到达检测器，降低整体荧光检测灵敏度。
线性可变滤光片（LVF）则通过过滤而非分解光，克服了杂散光问题。该光栅使用两片带有梯度涂层的滤光片，通过相对滑动两片线性滤光片，可筛选出任意波长和任意带宽的光。LVF光栅具有类似滤光片的透光特性，可消除杂散光，因此性能优于衍射光栅（图 6）。线性可变滤光片在酶标仪中的应用是 BMG LABTECH 的专利技术。
检测器
酶标仪中，荧光强度通过光电倍增管（PMTs）检测。光电倍增管利用光电效应放大信号，并将光信号转换为电信号。用于荧光强度检测的酶标仪配备两种光电倍增管，二者的敏感波长范围各不相同。低噪声蓝绿光电倍增管的敏感波长范围可达 740 纳米，常用于发光检测；红移光电倍增管可灵敏检测波长高达 900 纳米的荧光，因此也适用于红色和红外染料，这类染料常用于细胞检测，因为该波长范围的自发荧光较低。
如何在酶标仪上设置荧光检测
微孔板
荧光强度定量需使用黑色微孔板，因其可减少背景信号和激发光反射。关于微孔板选择的更多细节，可参考《微孔板：实际应用价值》（"The microplate: utility in practice"）。滤光片与光栅的设置
选择合适的滤光片是精准测定荧光强度的关键。如前所述，滤光片的中心波长应接近或等于荧光团的最大激发和发射波长，但需注意以下几点：
a) 滤光片间距
若激发滤光片与发射滤光片的边缘过于接近，激发光可能泄漏并到达检测器，导致荧光团信号被激发光掩盖，无法检测。滤光片之间的距离取决于滤光片的质量及是否使用二向色镜，通常情况下，激发光的最大透射波长与发射光的最小透射波长应相差 30 纳米以上（图 7）。
b) 带宽
滤光片的带宽从几纳米到 100 纳米不等，会影响透光量。窄带宽滤光片（约 10 纳米）推荐用于发光较强的荧光团，或自发荧光较高的复杂样品例如细胞环境中的 AlexaFluor488、FITC、GFP 等绿色荧光团；
若荧光团发射波长范围的自发荧光较低（发射波长 < 600 纳米），或缓冲液中无其他荧光化合物，则建议宽带宽滤光片用于发光较弱的荧光团。BMG LABTECH 会根据荧光团的激发和发射光谱选择滤光片，并对滤光片对进行匹配检测，确保提供最优滤光片；同时，光栅中已预存常见荧光团的默认设置，无需研究人员手动选择。
c) 荧光共振能量转移（FRET）检测需两个发射通道
上述滤光片选择原则同样适用于 FRET 检测，但需注意：FRET 检测需分别记录两种发射光 —— 若受体荧光团不在供体附近，被激发的供体荧光团会在特定波长发射光；若受体荧光团在供体附近，供体会将能量转移给受体，受体则发出更高波长的发射光。因此，FRET 检测需使用两种发射滤光片，分别允许供体和受体的发射光透过。
增益
荧光增益是一种放大系数，更准确地说，是检测器放大入射光信号的电压。调整增益可使检测的动态范围沿分析物 / 实验的浓度曲线移动，但动态范围的宽度固定不变。
弱信号需高放大倍数（高增益），强信号需低放大倍数（低增益）。增益选择不当会导致检测数据失效，要么超出检测范围，要么无法分辨信号差异。相关数据可参考操作指南《如何优化微孔板读数仪的增益设置？》（How to optimise the gain setting of your microplate reader?）。通常，增益设置需确保预期信号最强的样品达到最大检测输出，以在信号最大值与最小值之间获得尽可能大的动态窗口（图 8）。
只要确定了具有特定信号强度的孔，所有 BMG LABTECH 酶标仪均可自动确定增益； CLARIOstar Plus 和 VANTAstar 无需调整增益 —— 其 “增强动态范围（EDR）技术” 专为实现最大动态范围（8 个浓度数量级）设计，研究人员无需手动操作，即可在大动态范围内获得高可靠性结果。
聚焦高度
信号检测高度对检测灵敏度有显著影响，非最佳聚焦高度可能导致信号降低达 90%。例如，贴壁荧光细胞需在靠近孔底的位置检测，而均匀荧光溶液的最强信号出现在液体表面下方，且与孔内液体体积相关。部分酶标仪可在选定孔中确定最佳聚焦高度；CLARIOstar® Plus 和 VANTAstar® 则更进一步，可在读取微孔板的同时自动确定聚焦高度。
荧光实验 —— 荧光强度的应用场景
荧光实验的种类与它们所能解答的生物和化学问题一样丰富，以下概述基于荧光强度的常见应用场景：
细胞活性与细胞毒性实验
化合物是否对细胞造成损伤、癌细胞在治疗后是否死亡 —— 这些常见问题可通过荧光法活力与细胞毒性检测及酶标仪得到解答。
在 alamarBlue™检测中，刃天青（resazurin）会被代谢活跃的细胞还原为一种荧光团，进而反映细胞活力。另一种评估细胞活力的方法是将带荧光标记的核苷结合到DNA：只有当 DNA 发生复制（细胞活力的标志）时，这些标记核苷才会被结合并发出荧光。
通过荧光强度检测细胞死亡的方法基于 SYBR® Green 或 Celltox™ Green 等荧光 DNA 染料。这类染料无法穿透活细胞膜，但当细胞死亡导致细胞膜破裂时，染料会与溶液中的 DNA 接触并开始发出荧光（图 9）。
此类检测兼容实时测量，可随时间监测细胞健康状态。由于测量需持续数天，微孔板培养室需维持 37°C 温度和 5% CO₂浓度以保证细胞存活。配备环境控制单元（Atmospheric Control Unit）的 CLARIOstar Plus 已被证实能为长期细胞实验提供理想的培养环境。更多细胞健康检测相关内容可参考《细胞活力检测 —— 评估你的细胞 “状态”》。
酶活性实验
酶参与多种生物过程，研究抑制剂或激活剂对酶活性的影响具有重要意义。酶实验的原理类似：使用一种预荧光底物，在酶处理过程中释放出荧光团。常见的荧光团多为香豆素衍生物，例如在表观遗传酶组蛋白去乙酰化酶 1（HDAC1）的荧光实验中，可用于研究组蛋白去乙酰化酶的抑制情况。
4 - 甲基伞形酮（4-methylumbelliferone）是另一种用于酶实验的荧光团，相关实例可参考应用说明《CLARIOstar 通过荧光实验测定苔藓表达的人酸性 α- 葡萄糖苷酶（GAA）活性》（“CLARIOstar determines activity of a moss-produced human acid alpha-glucosidase (GAA) in a fluorescence-based assay ”）。
CLARIOstar Plus 多功能酶标仪简化了荧光酶活性分析：其增强动态范围技术支持 8 个数量级的动态范围检测，可轻松记录酶活性实验中不断增强的信号，无需担心增益选择错误或耗时的仪器优化；仪器还配备免费分析软件，内置酶动力学分析功能，支持米氏方程（Michaelis-Menten）和双倒数作图（Lineweaver-Burk）分析，相关细节可参考《基于 BMG LABTECH 微孔板读数仪的酶动力学检测》（Enzyme kinetic measurements performed on a BMG LABTECH microplate reader ）。
构象变化：蛋白质折叠与展开
色氨酸等天然氨基酸的荧光也可用于检测蛋白质的构象变化和酶活性，相关应用实例可参考《色氨酸荧光：自然界的探针》（Tryptophan fluorescence: nature’s probe）。例如，色氨酸荧光可用于筛选 G蛋白偶联受体（当前上市药物最热门的靶点之一）的新型治疗药物。
蛋白质聚集实验
蛋白质错误折叠会导致聚集，而蛋白质聚集与阿尔茨海默病、帕金森病、朊病毒病等疾病相关。分析分子聚集体的形成，有助于这些疾病的诊断、机制研究及潜在药物测试。
双 - ANS（bis-ANS）和硫黄素 T（ThT）两种荧光团与蛋白质聚集体相互作用时，荧光强度会升高：双 - ANS 优先与无定形聚集体结合（相关细节可参考应用说明《使用 BMG LABTECH 微孔板读数仪监测淀粉样蛋白形成》（“Use of a BMG LABTECH microplate reader to monitor amyloid formation”））；
硫黄素 T 则与纤维聚集体结合，主要用于动力学实验 —— 若样品中含有诱导聚集的分子，重组蛋白质会发生聚集，荧光强度随之升高（图 10）。
应用说明《朊病毒播种的实时震荡诱导转化实验》（“Real-time quaking-induced conversion assay for prion seeding”）阐述了该实验如何用于检测仓鼠脑匀浆中的羊瘙痒症（scrapie）朊病毒病。由于这类聚集实验需长期震荡，BMG LABTECH 酶标仪可配备高稳定性的震荡传输系统。
