CLARIOstar Plus
用于研发检测的高灵活度酶标仪
什么是荧光强度？
荧光基于光致发光原理，是一种物质吸收光后再释放光的发光过程。从物理角度来说，荧光是物质吸收光能量后发射光的现象，而荧光强度则指发射光（光子）的总量，代表了荧光的发射程度，其大小取决于受激发的荧光团浓度。
荧光由被称为 “荧光团” 的荧光分子吸收能量（光）后产生，吸收的能量使分子内电子跃迁至更高能级。由于激发态不稳定，电子会回落至基态，并在此过程中发射光（图 1）。
吸收的光子中，有一小部分能量会转化为分子的运动能和热能。因此，电子回落时释放的能量始终小于激发电子所需的能量。由于长波辐射的能量低于短波辐射，发射光的波长始终长于激发光波长。激发峰与发射峰（最大值）之间的波长差被称为 “斯托克斯位移（Stokes shift）”（图 2）¹。
激发光（吸收光）波长小于发射光波长这一特性，为荧光强度的分析应用提供了可能。通过特定波长激发荧光团，并在更长波长下测量其发射强度，即可检测荧光团。荧光强度与被激发荧光团的浓度呈线性相关，因此适用于定量分析。
荧光强度在生命科学领域应用广泛：在显微镜技术中用于生物分子的定位与定量，在流式细胞术中用于细胞分析，在微孔板实验中用于分子定量、酶活性检测，甚至分子间相互作用研究。本文将聚焦微孔板实验中荧光强度的应用，包括其检测方法、检测注意事项及常见实验类型。
荧光团
荧光团（又称荧光染料，fluorochrome）是一类受光激发后可发射光的荧光化合物目前已知具有荧光特性的化合物种类已达数千种，它们在结构与光学性质等方面存在显著差异，主要体现在以下几个关键参数。
分子大小
荧光团在分子尺寸上差异明显。多数化学荧光染料为小分子，便于与目标分子进行化学偶联。而绿色荧光蛋白（GFP）、红色荧光蛋白（RFP）等荧光蛋白则具有较大分子量，可通过基因表达方式在细胞内原位产生。此类荧光蛋白广泛用于蛋白标记、表达水平分析、生物传感器构建以及细胞定量标记等应用。例如，VANTAstar酶标仪 可对基于 GFP 或 mCherry 的转染效率进行高精度检测。
激发与发射波长
荧光团的光学特性通常以激发光谱与发射光谱表示：横坐标为波长（nm），纵坐标为相对强度。光谱一般经归一化处理（最大值设为100%），以便直观比较最大激发波长、最大发射波长及斯托克斯位移。合理选择荧光团时，需确保其光谱特性与检测系统匹配，同时避免与样品自发荧光或其他荧光标记发生光谱重叠。
量子产率
量子产率是衡量荧光团发光效率的核心参数，定义为吸收光子中转化为发射光子的比例。结合分子的消光系数（即吸光能力），量子产率共同决定荧光团的整体亮度，是评估检测灵敏度的重要指标。
FRET 对由两种荧光团组成
荧光共振能量转移（FRET，Förster´s Resonance Energy Transfer）指能量从供体荧光团转移至受体荧光团的过程。当供体发射光谱与受体激发光谱存在重叠，且两者空间距离足够接近时，能量可从供体无辐射转移至受体。该过程广泛用于分子相互作用分析及生物传感器设计。在生物传感器应用中，当分析物结合时，传感器会改变构象，使两种荧光团相互靠近。FRET的发生需要供体的发射光谱与受体的激发光谱存在一定重叠 ³（图 3）。
荧光强度检测
尽管荧光团各不相同，但微孔板中荧光强度检测的基本原理一致（图 4），具体流程如下：
- 光源产生广谱光
- 经滤光片或光栅筛选获得特定范围的激发波长
- 激发光照射样品并激发荧光团发射荧光
- 从发射光中筛选出特定范围的发射波长
- 检测器对筛选后的荧光信号进行定量分析
与吸光度不同，荧光强度检测属于相对测量方法。其信号强度通常以相对于参考样品或仪器基线的形式进行比较，因此荧光酶标仪 通常采用“相对荧光单位”（Relative Fluorescence Units，RFU）对样品信号进行表征。
光源
酶标仪常用的光源有三种，其性能差异会直接影响检测灵敏度与适用范围：更多细节可参考操作指南《闪光次数如何影响检测结果？》。
氙闪光灯
氙闪光灯的发射波长范围覆盖约 200–2500 nm，可激发从紫外到近红外范围内的多种荧光分子，具有输出强度高、稳定性好及使用寿命长等优势。因此，BMG LABTECH 多功能酶标仪普遍采用氙闪光灯作为荧光检测的激发光源。
钨卤素灯
钨卤素灯的发射波长通常起始于约 360 nm，在紫外区输出较弱，不适用于紫外荧光检测。同时，其光强与使用寿命均低于氙闪光灯，应用于荧光检测时整体灵敏度相对有限。
发光二极管
发光二极管（LED）具有较高的发光强度与良好的稳定性，但其发射光谱较窄，仅覆盖特定波段。因此，在需要多激发波长的实验中，通常需配置多个LED光源，这在一定程度上增加了系统复杂性与成本。
波长筛选
广谱激发光源可覆盖从紫外到红外的宽波长范围。为实现对目标荧光团的特异性激发并降低非特异性信号干扰，需对激发光进行筛选，仅允许接近荧光团最大激发波长的光通过；同样，对发射光进行筛选，仅保留接近最大发射波长的信号。通过这一过程，可有效确保仅目标荧光被导入检测器，从而提升检测灵敏度与信噪比。
部分荧光酶标仪在激发与发射光路之间引入二向色镜（dichroic mirror） 以进一步优化光谱分离。该元件通常允许高于某一截止波长的光透过，同时反射低于该波长的光，其截止波长位于激发与发射波长之间，从而有效减少激发光泄漏至检测器的可能性。
滤光片
光学滤光片是带有特定光学涂层的玻璃元件，仅允许特定波长范围的光透过。不同荧光团需匹配对应激发与发射滤光片。滤光片通常以“中心波长”命名，并配有带宽参数（bandwidth），用于描述透光范围。例如，中心波长为485 nm、带宽为10 nm的滤光片，可选择性透过约480–490 nm范围内的光。
光栅
与固定波长的滤光片不同，光栅（单色器）可实现波长的连续可调。酶标仪中常见两类光栅系统：传统衍射光栅（grating-based monochromators）和线性可变滤光片（linear variable filter, LVF）。
传统光栅通过衍射将白光分解为不同波长，并借助狭缝选择目标波长。然而，该过程透光效率较低，且易产生杂散光，从而降低检测灵敏度。
线性可变滤光片（LVF）则通过空间梯度涂层实现波长选择，无需光的衍射分解，可在保持较高透光率的同时显著降低杂散光干扰。通过调节滤光片位置，可获得不同中心波长及带宽，其性能接近传统滤光片，并优于衍射光栅（图 6）。线性可变滤光片在酶标仪中的应用是 BMG LABTECH 的专利技术。
检测器
在荧光强度检测中，信号通常由光电倍增管（Photomultiplier Tube, PMT）进行采集。PMT基于光电效应，可将微弱光信号放大并转换为电信号，从而实现高灵敏度检测。
用于荧光强度检测的酶标仪配备两种光电倍增管，二者的敏感波长范围各不相同。低噪声蓝绿光PMT的检测范围可延伸至约740 nm，适用于常规荧光与发光检测；而红移PMT可检测高达约900 nm的信号，更适用于红色及近红外荧光染料。这类长波长检测在细胞实验中尤为重要，因为该波段通常具有更低的自发荧光。
如何在酶标仪上设置荧光检测
微孔板
进行荧光强度定量时，通常选择黑色微孔板。其低反射特性可有效减少激发光散射与孔间串扰，从而降低背景信号并提升检测信噪比。关于微孔板选择的更多细节，可参考《微孔板：实际应用价值》（"The microplate: utility in practice"）。滤光片与光栅的设置
合理选择滤光系统是获得可靠荧光数据的关键。激发与发射滤光片的中心波长应接近荧光团的最大激发与发射波长，同时需兼顾光谱分离与信号强度。但需注意以下几点：
a) 滤光片间距
激发与发射滤光片的光谱需保持足够分离，以避免激发光泄漏至检测器。若两者透射边缘过于接近，激发光可能掩盖荧光信号，降低检测准确性。通常建议激发光最大透射波长与发射光最小透射波长之间至少保持约30 nm 的间隔；具体间距还与滤光片质量及是否配置二向色镜有关（图 7）。
b) 带宽
滤光片的带宽从几纳米到 100 纳米不等，直接影响透光量与选择性。窄带宽滤光片（约 10 nm）适用于发光强的荧光团或背景自发荧光较高的体系（如细胞样品中的 Alexa Fluor 488、FITC、GFP 等），可提高选择性并降低背景干扰。
宽带宽：适用于发光较弱的荧光团或背景干扰较低的体系（如发射波长 < 600 nm 且缓冲体系简单），可有效提高信号强度。BMG LABTECH 会基于荧光团光谱特性对滤光片进行优化匹配；对于采用光栅系统的仪器，常见荧光团参数通常已预设，无需手动配置。
c) 荧光共振能量转移（FRET）检测需两个发射通道
上述滤光片选择原则同样适用于 FRET 检测，但需特别注意发射信号的双通道采集。FRET 实验必须分别记录供体与受体两种发射光信号： 当受体荧光团未与供体处于有效作用距离内时，体系仅表现为供体被激发，并在其特征波长处发射荧光；而当受体与供体空间接近时，供体激发能量将通过非辐射方式转移至受体，受体随后在更长波长处发射荧光。因此，在实验设置中需配置两组发射滤光片：一组用于检测供体发射信号，另一组用于检测受体发射信号。通过对两通道信号的同时或序贯采集与比值分析，可实现对分子相互作用及构象变化的定量评估。
荧光增益
荧光增益本质上是检测器对入射光信号的放大系数，更准确地说，是对光电倍增管（PMT）输出电压的放大调节参数。通过调整增益，可以在一定程度上改变检测信号在分析物浓度曲线中的位置，但不会改变仪器本身的动态范围宽度。
弱荧光信号通常需要较高增益以实现有效放大，而强信号则需采用较低增益以避免信号饱和。若增益设置不当，可能导致数据超出检测线性范围或信号差异无法有效区分，从而影响实验结果的可靠性。相关参数可参考操作指南《如何优化微孔板读数仪的增益设置？》。增益参数的合理设置对数据质量至关重要。通常应以预期信号最强样品作为参考，将其调整至接近最大检测输出，以在不发生饱和的前提下获得尽可能宽的动态窗口（图8）。
在实际操作中，多数 BMG LABTECH 酶标仪支持基于标准孔的自动增益优化功能，可自动确定合适的放大参数。对于 CLARIOstar Plus 和 VANTAstar 等酶标仪，则无需手动调整增益，其内置的增强动态范围（Enhanced Dynamic Range, EDR）技术可在单次检测中实现覆盖高达 8 个数量级的信号范围，从而在无需人工干预的情况下保证数据的高准确性与高重复性。
聚焦高度
检测时的聚焦高度对荧光信号灵敏度具有显著影响。若未处于最佳聚焦位置，信号强度可能下降高达90%。因此，合理设置或优化聚焦高度是保证数据质量的重要参数。
例如，
对于贴壁生长的荧光细胞，应将检测焦点设置在接近孔底的位置，以最大化细胞信号采集效率；而对于均匀分布的荧光溶液体系，最强信号通常出现在液面以下一定深度，其最佳检测高度还会受到孔内液体体积的影响。
部分酶标仪支持在预选孔中手动或半自动确定最佳聚焦高度， CLARIOstar Plus 与 VANTAstar 进一步实现了自动化优化功能，可在微孔板读取过程中实时确定最佳 Z 轴聚焦位置，从而在无需人工干预的情况下保证信号采集的最大化与一致性。
荧光实验 —— 荧光强度的应用案例
荧光实验的类型与其能够解决的生物学和化学问题十分多样。以下概述基于荧光强度检测的典型应用
细胞活性与细胞毒性实验
化合物是否对细胞产生毒性、或癌细胞在处理后是否死亡，是细胞生物学与药物筛选中的核心问题之一。这类问题通常可通过荧光法细胞活性/毒性检测结合酶标仪进行定量分析。
在 alamarBlue™检测中，刃天青（resazurin）可被代谢活跃的细胞还原为具有荧光性质的产物，从而反映细胞代谢活性与存活状态。另一类方法是利用荧光标记核苷类似物掺入DNA。只有在细胞发生DNA复制（细胞增殖的标志）时，这些标记分子才会被整合进入新合成的DNA链并产生荧光信号，从而间接反映细胞活性。
细胞死亡检测则通常基于 SYBR® Green 或 CellTox™ Green 等DNA结合型荧光染料。这类染料通常无法穿透完整细胞膜，但当细胞死亡导致膜完整性丧失后，染料可进入细胞并与DNA结合，从而产生荧光信号（图9）。
此类检测方法支持实时动力学监测，可连续追踪细胞状态变化。由于实验通常持续数天，微孔板培养系统需维持稳定的37°C温度及5% CO₂环境以保证细胞生长条件。配备环境控制单元（Atmospheric Control Unit）的 CLARIOstar Plus 可在检测过程中维持理想培养环境，从而支持长期细胞实验的连续监测与高稳定性数据采集。更多细胞检测相关内容可参考《细胞活力检测 —— 评估你的细胞 “状态”》。
酶活性实验
酶参与多种关键生物过程，因此研究抑制剂或激活剂对酶活性的影响具有重要意义。荧光法酶活性检测通常采用预荧光底物，在酶催化过程中释放荧光团，从而实现信号生成与定量分析。常见荧光团多为香豆素衍生物。例如，在表观遗传相关酶组蛋白去乙酰化酶1（HDAC1）的检测中，可利用荧光底物评估其去乙酰化活性及抑制剂效应。
此外，4-甲基伞形酮（4-methylumbelliferone）也是常用荧光团之一，广泛用于多种水解酶检测体系，相关实例可参考应用说明《CLARIOstar 通过荧光实验测定苔藓表达的人酸性 α- 葡萄糖苷酶（GAA）活性》（“CLARIOstar determines activity of a moss-produced human acid alpha-glucosidase (GAA) in a fluorescence-based assay ”）。
CLARIOstar Plus通过增强动态范围（EDR）技术实现高达8个数量级的信号检测范围，可稳定记录酶反应过程中随时间变化的荧光信号，避免因增益设置不当导致的数据失真。同时，其内置分析软件支持酶动力学参数拟合，包括Michaelis-Menten kinetics与Lineweaver–Burk双倒数分析，为酶学研究提供一体化解决方案。相关细节可参考《基于 BMG LABTECH 微孔板读数仪的酶动力学检测》（Enzyme kinetic measurements performed on a BMG LABTECH microplate reader ）。
构象变化：蛋白质折叠与展开
蛋白质内源性荧光（尤其是色氨酸残基）可用于监测构象变化及酶活性状态。色氨酸荧光对微环境变化高度敏感，因此可作为天然结构探针，用于分析蛋白质折叠与展开过程。相关应用实例可参考《色氨酸荧光：自然界的探针》（Tryptophan fluorescence: nature’s probe）。例如，色氨酸荧光可用于筛选靶向G蛋白偶联受体（当前药物发现最热门的靶点之一）的新型治疗药物。
蛋白质聚集实验
蛋白质错误折叠可导致聚集体形成，与阿尔茨海默病、帕金森病及朊病毒病等多种神经退行性疾病密切相关。因此，对蛋白质聚集过程的监测对于疾病机制研究与药物筛选具有重要意义。
双 - ANS（bis-ANS）和硫黄素 T（ThT）两种荧光团与蛋白质聚集体相互作用时，荧光强度会升高：双 - ANS 优先与无定形聚集体结合（《使用 BMG LABTECH 微孔板读数仪监测淀粉样蛋白形成》）；
而硫黄素T（Thioflavin T，ThT）则选择性结合β-折叠富集的淀粉样纤维结构。在结合聚集体后，两者荧光强度均显著增强，其中ThT更常用于聚集动力学分析（图 10）。
应用说明《朊病毒播种的实时震荡诱导转化实验》）阐述了该实验用于检测仓鼠脑匀浆中的羊瘙痒症（scrapie）朊病毒病。由于该类实验通常需要长时间震荡培养，因此对酶标仪的机械稳定性与环境控制能力提出较高要求。 BMG LABTECH 酶标仪可配备高稳定性的震荡传输系统助力此类研究。
