荧光偏振

荧光偏振检测的理论基础

荧光偏振检测基于稳态荧光检测的通用理论（详见荧光强度相关页面），此外，其检测原理还依赖两个核心事实：一是荧光团的偏振程度与其翻滚速率呈负相关；二是荧光团发射的光在不同偏振平面（通常为与激发平面垂直和平行的平面）上的强度存在差异。

当平面偏振光激发小分子（通常分子量 < 1.5 kDa）且未结合的荧光分子（示踪剂）时，该分子主要发射非偏振光。这是因为小分子游离状态下在溶液中旋转迅速， 在激发到发射的时间间隔内，分子会沿多个方向旋转，从而在不同偏振平面上发射光（即非偏振光）。

相反，若该小分子荧光分子与大分子（通常分子量 > 10 kDa）结合，其分子体积增大导致旋转速率减慢，最终发射的光会主要与激发光源处于同一偏振平面（图 2）。

荧光偏振的定量计算

荧光偏振本质上是对示踪剂在 “激发 - 发射” 时间间隔内分子旋转程度的测量，其计算公式如下：

p = (f|| - f⊥)/(f|| + f⊥)

从定量角度看，荧光偏振值（P）定义为：与激发光平面平行的发射荧光强度（F||）和垂直的发射荧光强度（F⊥）的差值，除以总发射荧光强度（平行与垂直强度之和）¹。

P 值为无量纲数（由光强度比值计算得出），通常以毫偏振单位（mP）表示，1 P = 1000 mP。尽管 P 值的理论范围为 - 330~500 mP，但实际应用中极少达到这一极限。在生物分析应用中，典型数据范围为 10~300 mP（例如图 3）。

荧光偏振与各向异性

“各向异性”（Anisotropy）一词于 1960 年被提出，常用于偏振发射相关场景。各向异性（用 A 或 r 表示）的计算公式如下：

r = (F|| - F⊥)/(F|| + 2 F⊥)

F|| 表示垂直偏振激发光经垂直偏振片筛选后的发射光强度。F⊥表示垂直偏振片用于激发光、水平偏振片用于发射光时的发射光强度 ²。

荧光偏振与各向异性在数学上存在关联，且经常互换使用 —— 两者均由偏振光和非偏振光的发射强度推导得出，代表荧光分子结合 / 未结合状态的平均值。对于大多数应用，两者的信息含量完全相同，各向异性并不会提供额外信息 ³。

通常，选择使用 “偏振” 还是 “各向异性”，取决于实际需求和使用习惯：“荧光偏振” 更常用于描述整个技术体系及临床化学领域，而 “各向异性” 在生物物理学和生物化学领域更为常见。

荧光偏振如何检测？

荧光偏振可通过酶标仪检测，其基本流程和装置与荧光强度检测一致，但有一些不同之处，主要与偏振平面的选择有关。

样品由垂直（平行）偏振光在特定波长下激发。激发光源通常为氙灯或卤钨灯，其发出的白光会通过滤光片或光栅进行光谱过滤。偏振片（一种特定滤光片）用于筛选偏振面。

自然光的电场矢量可沿相对于传播方向的任意方向振动。偏振片是一种光学元件，通常为薄膜，能够分离出电场矢量的单一方向。激发偏振片置于激发光源与样品之间，其垂直面的相对方向可使平行光透射到样品，并阻挡垂直偏振光。

样品发出的光通过滤光片或光栅进行光谱过滤，以去除杂散波长。此外，需根据发射光相对于偏振激发光偏振面的方向，将其分离为平行波或垂直波。这一过程通过放置于样品与检测器之间的光路中的发射偏振片实现，该偏振片的类型通常与激发偏振片相同。最终，两个偏振面的光强度由检测器（通常为光电倍增管，PMT）进行定量。

两个偏振面需分开检测。最简单的方法是通过两次连续测量分别检测平行面和垂直面：第一次测量先检测平行偏振光强度，随后将发射偏振片旋转 90°，再检测水平面（垂直）偏振光强度（图 4）。

得益于同步双发射检测技术，像 PHERAstar FSX 这样的高端荧光偏振酶标仪能够同时采集两个偏振面的信号。这种方法不仅节省时间，还能减少两次连续测量所产生的变异性。

荧光偏振检测的注意事项

一般情况下不推荐使用光栅，因为光栅光透射率低、背景（杂散光）高，会增加样品检测的变异性，对检测窗口和结果稳定性产生负面影响。

若要在紫外光区进行检测，读数仪必须配备氙灯。不建议使用卤钨灯，因为其在 400 nm 以下波长的发射强度较弱。此外，还需使用专用的紫外偏振片，常规偏振片在紫外波长下的透射率较低。

低偏振度（P）表明荧光分子未发生结合，在溶液中自由运动。高偏振度（P）则表明存在较大的分子复合物。尽管生物分析应用中的测量范围通常在 10 至 300 mP之间，看似较为狭窄，但借助 PHERAstar FSX 或 CLARIOstar Plus 等高端多功能酶标仪，可实现极为精准的测量，标准偏差仅为 ±0.5 mP。

荧光偏振实验用荧光团

在荧光偏振（FP）实验中，荧光染料的选择至关重要。其激发光谱和发射光谱必须与溶液中其他分子的波长不同，以减少自发荧光干扰；同时需具备较大的斯托克斯位移，以减少光散射的负面影响。荧光团需易于与示踪剂偶联，但既不能干扰示踪剂的翻滚运动，也不能影响相互作用过程。此外，它们还必须具有高量子产率（即高发光强度），且具备化学稳定性和光稳定性。⁴

最常用的荧光团是异硫氰酸荧光素（FITC）及光谱特性与之相似的染料。不过，近年来在现酶标仪性能提升的推动下，Cy3B、Cy5 等红色染料的应用日益广泛。由于信号检测技术的改进，这类染料固有的低光子产率已不再是限制因素。使用红色染料具有明显优势：可减少通常在蓝绿光区发射的自发荧光所导致的假阴性结果，以及由光散射现象引起的假阳性结果。⁵

荧光偏振的优势

在研究分子结合事件的各类方法中，荧光偏振（FP）独具特色。由于其基于单一荧光标记策略，因此无需额外的分离步骤。相较于传统方法，这意味着可使用更少且通常成本更低的试剂。此外，由于不会影响样品完整性，只要 pH 值、温度和黏度保持恒定，往往可对样品进行重复测量。

荧光偏振能够直接实时监测溶液中示踪剂的游离 / 结合比率，可对极低浓度（通常低至皮摩尔级）的样品进行平衡分析。同时，凭借其实时检测的特性，实验不局限于平衡状态，还能轻松分析结合 / 解离动力学过程。

荧光偏振是一种均相检测技术，采用简单的 “混合即读” 操作流程，无需分离结合态与游离态的待检测物质。均相实验能更准确地定量结合事件，因为结合反应不会受到额外步骤的干扰。但需注意的是，其他均相实验（如 FRET、TR-FRET 或 AlphaScreen®）除了需对示踪剂进行单一标记外，还需要额外的标记反应，而荧光偏振则无此需求。

此外，荧光偏振的比率测量特性可消除化合物吸光度或淬灭作用对数据采集的负面影响，且支持实验微型化。以上所有原因，使得荧光偏振实验被广泛应用于高通量筛选中。

荧光偏振的局限性

尽管荧光偏振（FP）具备诸多优势，但该测量系统仍存在一些局限性。FP 需要分子体积发生较大变化，才能产生最大信号和检测窗口。理想情况下，荧光偏振结合实验可监测小分子与大分子之间的相互作用，且需用荧光团标记最小的相互作用伙伴。因此，示踪剂通常为小蛋白质、肽、细胞因子和化合物。这通常能确保结合后分子体积产生尽可能大的差异，从而获得最大的检测窗口。荧光偏振结合实验不适用于观察两种大蛋白质之间的相互作用。

此外，化合物的自发荧光和光散射可能导致假象。因此，通常建议在添加荧光染料前先定量孔中的荧光背景，并在计算时将其扣除。由于自发荧光在较高波长下通常不那么明显，因此采用 BODIPY TMR 或 Cy5 等红色染料可最大限度降低背景噪⁶,⁷。

应用领域：荧光偏振结合实验

荧光偏振（FP）结合实验可用于分析多种分子相互作用或解离事件，包括蛋白质 - 配体、肽 - 蛋白质的相互作用、蛋白质 - DNA 相互作用，以及原纤维前体蛋白质的聚集。此外，该实验还可用于鉴定干扰化合物和非特异性抑制剂。

其他应用领域包括：分析脂质体和线粒体膜中的膜流动性；开展实时酶促实验，如蛋白水解、RNA 合成、结合动力学以及泛素缀合 / 去缀合实验（图 5）。泛素相关的实时应用可用于靶向蛋白质降解研究，例如蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）或分子胶相关研究，包括它们与靶点的结合活性及相互作用动力学研究。荧光偏振结合实验还可用于观察由已知降解子与连接酶之间特异性相互作用所引发的靶向蛋白质降解过程。

小分子筛选中的荧光偏振实验

20 世纪 90 年代，荧光偏振（FP）技术被引入药物筛选领域，以推动药物研发进程。如今，凭借其均相、快速且可定量的特点，荧光偏振已成为筛选机构的常规工具。由于荧光偏振值通常与示踪剂的结合 / 游离百分比呈线性相关，因此它常被用于测定候选药物的IC50值。

在药物研发中，荧光偏振实验已被用于研究多种靶点，如 G 蛋白偶联受体（GPCRs）、激酶、磷酸酶和蛋白酶等。在相互作用研究中，荧光偏振通常通过检测分子体积的增大来反映结合事件；而在解离实验和酶促降解实验中，分子体积的减小则通常被用作检测指标。

荧光偏振实验在高通量筛选（HTS）中的主要应用包括直接分子相互作用分析和酶促反应分析。在此类研究中，快速且灵敏的酶标仪能够针对日益广泛靶点类别的小分子进行高效筛选。例如，可用于泛素化调节因子及抗癌靶点 CSN5 的抑制剂，以及H - 前列腺素 D 合酶抑制剂的筛选。

同源 FRET 荧光偏振

FRET是研究相互作用事件的常用方法。通常情况下，两个待研究的相互作用对象会分别用两种不同的荧光团（供体和受体）进行标记。不过，能量转移也可发生在相同类型的荧光团之间，即同源FRET（homoFRET）。荧光偏振（FP）技术可应用于同源FRET 研究，因为能量转移会导致发射偏振方向随机化，从而产生去偏振信号。如应用说明《利用同源 FRET-FP 检测监测活细胞中胰岛素颗粒的包装》中所述，同源 FRET-FP 可用于研究细胞内的蛋白质聚集或二聚化事件（图 6）。

荧光偏振免疫分析法（FPIA）

荧光偏振免疫分析法（FPIA）是最早应用于生物化学领域的技术之一，它是一种用于检测抗原或抗体的竞争性生化检测方法。在荧光偏振免疫分析中，与荧光团结合的抗原被用作示踪剂。该示踪剂与另一抗原通常会竞争结合特定抗体：示踪剂与抗体的高结合率通常会产生偏振信号；而若未标记的抗原优先与抗体结合，则游离的示踪剂会产生非偏振光。这种信号变化与样品中抗原的含量呈正比。⁸

参考文献

1. Lakowicz JR，《荧光光谱学原理》，第三版，2010 年。
2. Jablonski A. 1960.On the notion of emission anisotropy.Bull l'Acad Pol Sci, Ser A 8:259-264.
3. Mocz G. 荧光偏振和各向异性的信息含量。J Fluoresc.2006 Jul;16(4):511-24.
4. Zhang，H.；Yang，S.；De Ruyck，K.；Beloglazova，N.V.；Eremin，S.A.；De Saeger，S.；Zhang，S.；Shen，J.；Wang，Z. 食品和环境分析中化学污染物的荧光偏振测定。TrAC Trends Anal.Chem.2019, 114, 293-313.
5. Turek-Etienne TC, Small EC, Soh SC, Xin TA, Gaitonde PV, Barrabee EB, et al: Evaluation of fluorescent compound interference in 4 fluorescence po-larization assays: 2 kinases, 1 protease, and 1 phosphatase.J Biomol Screen.2003;8:176-184.
6. Owicki JC.高通量筛选中的荧光偏振和各向异性：观点和入门。J Biomol Screen.2000;5(5):297-306.
7. Turek-Etienne TC, Lei M, Terracciano JS, et al.J Biomol Screen.2004;9(1):52-61.
8. 用于测定人血清和血浆中游离霉酚酸的灵敏快速荧光偏振免疫分析法》。Bettina Glahn-Martínez、Elena Benito-Peña、Francesca Salis、Ana B．Descalzo, Guillermo Orellana, and María C. Moreno-Bondi Analytical Chemistry 2018 90 (8), 5459-5465.