PHERAstar FSX
功能强大，高度灵敏的HTS酶标仪
什么是 TR-FRET？
时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）是一种将时间分辨荧光（TRF）与荧光特共振能量转移（FRET）的检测技术，广泛应用于分子相互作用解析及高通量药物筛选。
FRET 描述了两个荧光基团之间的非辐射能量转移过程，该理论由德国科学家 Theodor Förster 提出¹。当供体荧光基团被激发至电子激发态后，其能量可在满足空间与光谱条件的情况下转移至邻近的受体荧光基团，从而导致供体荧光信号减弱，同时受体荧光信号增强。
该能量转移过程需满足两个关键条件：其一，供体与受体之间的距离通常应处于 20–90 Å 范围内，且能量转移效率与分子间距离的六次方成反比，因此对距离变化高度敏感；其二，供体的发射光谱与受体的吸收光谱之间需存在有效重叠。与此同时，为实现信号的有效分辨，FRET 对的发射峰需具有足够的光谱间隔，以降低串色干扰，同时保证能量转移效率（图 1A）。
在生物学研究中，FRET 常采用基因编码荧光蛋白作为标记分子，其中包括绿色荧光蛋白（GFP）、青色荧光蛋白（CFP）、黄色荧光蛋白（YFP）及红色荧光蛋白（RFP）等²。
FRET 技术通常用于研究分子间相互作用、构象变化及结合事件，并可用于定量分析结合亲和力。实验中通常将待研究的两个结合分子分别标记供体与受体荧光团，通过检测能量转移效率来评估其相互作用强度（图 1B、C）。然而，传统 FRET 易受到激发光散射及样品自发荧光的干扰，从而限制其在高灵敏度检测中的应用。
TR-FRET 原理
时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）结合了时间分辨荧光（TRF）与荧光共振能量转移（FRET）的技术优势，通过引入延时检测策略，有效消除了激发光散射及样品自发荧光所产生的瞬时背景信号。 这得益于将镧系元素用作供体荧光团。这类荧光基团具有较大的斯托克斯位移及毫秒级荧光寿命，使其发射信号能够在短寿命背景荧光衰减后被选择性检测 。
TR-FRET 基于镧系供体与短寿命受体荧光团在空间接近时发生的非辐射能量转移过程。相较于传统 FRET，TR-FRET 通过长寿命荧光检测与时间门控策略，显著降低了非特异性背景干扰，提高了检测的稳定性与特异性。
目前，不同商业试剂体系在具体实现形式上略有差异，但其基本原理一致。 常见平台包括 HTRF®、LANCE®、LanthaScreenTM 和THUNDERTM。 这些体系通常通过两种策略实现信号构建：其一，将供体和受体荧光团分别与相互作用的分子共价偶联；其二，利用针对目标分子或其标签的特异性抗体分别标记供体与受体。在检测过程中，激发供体后，若两个标记分子因相互作用而处于近距离状态，则发生能量转移并产生受体荧光信号。最终检测到的TR-FRET信号强度或比值与分子间结合或相互作用程度呈正比。
TR-FRET 技术
在 TR-FRET 技术体系中，不同制造商在荧光标记物的选择及供受体配对策略上存在一定差异。
- TR-FRET 的供体荧光团通常采用镧系元素，如铕（Eu³⁺）或铽（Tb³⁺）（图 2）。由于游离态铕离子和铽离子的发光效率较低，需通过配位嵌入具有“天线效应”的配体结构中以增强其光学性能。常用的配体包括螯合物（chelates）和穴状配体（cryptates），这类结构不仅能够高效吸收激发能量，还可将能量传递至镧系离子，从而显著增强其荧光发射强度。铽配合物通常表现出更高的量子产率（相较于铕可高出约10–20倍）及更大的摩尔消光系数，这些特性有助于提高信号强度与检测灵敏度，从而提升高通量筛选性能³。此外，基于螯合物或穴状配体构建的镧系复合物在多种化学环境中具有优异的稳定性，并表现出较强的抗光漂白能力，优于传统有机荧光染料。
- TR-FRET 的受体荧光团通常为发射波长位于可见光区（绿色或红色范围）的有机荧光分子。为实现高效的共振能量转移，受体的激发光谱需与供体的发射光谱充分重叠。通常情况下，红色荧光受体可与铕或铽供体配对使用，而绿色荧光受体则更常与铽供体匹配，以获得更优的能量转移效率与信号分辨率。
TR-FRET 检测
在 TR-FRET 检测体系中，镧系供体荧光团的激发波长通常为 320-340 nm。铕（Eu³⁺）的发射峰通常在 620 nm 附近检测，而铽（Tb³⁺）则可根据具体试剂体系，在约 490 nm 或 620 nm 波长处进行检测。受体方面，绿色荧光团的发射波长为 520 nm，红色荧光团的发射波长为 665 nm。供体的发射信号用作内部参照，而受体的发射信号则是能量转移（结合事件）发生的指标（图 3）。
TR-FRET 在激发与信号采集之间引入了微秒级时间延迟，使非特异性短寿命背景荧光（如散射光及样品自发荧光）在检测前充分衰减。随后，在设定的微秒级时间窗口内对供体与受体的发射信号进行采集（图 4）。具体的延迟时间及检测窗口参数可根据不同试剂盒及仪器平台进行优化设置。
最终，TR-FRET 通常采用双通道信号的积分强度比值（acceptor/donor ratio）进行定量分析。该比率检测策略能够对信号进行内在归一化处理，有效降低培养基成分、荧光猝灭效应以及液体处理误差或孔间差异对结果的影响 。
TR-FRET 的优势
TR-FRET 技术因其高灵敏度与良好的方法学适应性，被广泛应用各项研究。时间分辨检测与比率检测策略的结合，显著拓宽了检测窗口，并有效降低了由激发光散射及样品自发荧光引起的背景干扰，从而提升检测的信噪比与数据可靠性。此外，镧系供体荧光团具有优异的光物理性质，其发射信号具有极低的光漂白效应和较长的荧光寿命，使检测过程具有良好的时间稳定性。同时，该体系对多种缓冲条件及实验体系具有较强的兼容性，适用于不同类型的生物检测场景。
TR-FRET 的核心优势在于其均相检测模式。在检测分子结合事件时，无需对结合态与游离组分进行物理分离，即可实现低背景信号的精准测定。该“加样-检测”模式避免了传统方法中的洗涤步骤（图 5） ，显著简化实验流程并缩短检测时间。相较于酶联免疫吸附测定（ELISAs），TR-FRET 在操作便捷性及检测效率方面具有明显优势，因此特别适用于自动化高通量筛选（HTS）研究 。
尽管如此，TR-FRET 技术仍存在一定局限性。例如，体系中的外源性化合物或生物分子可能通过荧光猝灭或光谱干扰影响能量转移过程，从而可能产生信号猝灭 ³ 。因此，在实际应用中需对潜在干扰因素进行合理评估与优化。
多种 TR-FRET 试剂盒
目前，多家厂商均提供基于 TR-FRET 原理的检测试剂盒。各类试剂体系均建立在相同的时间分辨荧光共振能量转移机制之上，且通常可在酶标仪平台上完成检测。尽管所有检测均基于相同的核心技术，且均可通过酶标仪检测，不同试剂盒和制造商之间仍存在差异。不同产品在关键技术参数上仍存在差异。这些差异主要体现在供体与受体荧光团的类型及配对策略、标记方式，以及激发后延迟时间与检测窗口等检测参数的设置上，从而在灵敏度、动态范围及应用适配性方面表现出不同特性。
- HTRF：均相时间分辨荧光（HTRF）技术采用四种特定荧光团，可组成不同的荧光对。HTRF 的供体荧光团通常为铕或铽的穴状配合物（cryptates） 。受体荧光团主要为发射于红光区域的染料，包括第一代 XL665（来源于红藻的藻胆蛋白衍生物）以及第二代 d2（结构类似于 XL665，但分子尺寸更小）。上述两类受体均可与铕或铽供体高效配对。此外，基于铽供体较宽的发射谱特性，其还可与绿色荧光受体组合使用，从而支持多重检测应用（图 6）。
- LANCE：镧系螯合物激发（LANCE）技术是一种基于铕螯合物供体和两种不同受体分子（Surelight® APC 与 ULight™）的 TR-FRET 技术。其中 ULight™ 作为第二代受体荧光团，具有更低的分子量（<800 Da）及优化的光物理性质。
- LanthaScreen：LanthaScreen 最初以铕与别藻蓝蛋白（APC）或 Alexa Fluor647 为基础，后经优化采用铽与荧光素或 GFP 作为荧光对。铽供体的引入显著提升了系统的光谱灵活性及检测性能。 由于 APC 分子量较大（>100 kDa），通常以链霉亲和素偶联物的形式存在，并以三分子复合物形式与生物素化底物结合，这在一定程度上可能引入空间位阻效应。铽与荧光素或 GFP 组合时，可直接标记底物，克服了铕- APC 组合存在的空间位阻问题。此外，GFP 作为受体的引入，使该技术可直接应用于 GFP 融合蛋白体系，甚至支持在活细胞环境中开展检测，显著拓展了应用场景。
- Transcreener® TR-FRET 检测：该检测主要用于监测酶促反应中产生的核苷酸副产物，如 ADP、AMP/GMP、UDP 和 GDP。针对每种核苷酸我们均提供竞争性 TR-FRET 免疫检测试剂盒。通过对这些核苷酸的定量分析，可研究核苷酸依赖性酶的酶活性。Transcreener 检测采用竞争性检测模式：特异性抗体与铽螯合物供体偶联，示踪核苷酸则标记红色荧光受体。 当体系中存在“天然”核苷酸产物时，其可竞争性取代示踪剂与抗体结合，从而抑制供体与受体之间的能量转移，导致 TR-FRET 信号降低。因此，该方法通过“信号反向变化”实现对靶分子的定量检测，适用于核苷酸依赖性酶活性的分析。
- THUNDER TR-FRET：这是一种基于 FRET 对的技术，显示出更强的光谱兼容性和 TR-FRET 信号。THUNDER 检测采用长寿命且稳定性高的铕螯合物作为供体，并结合在远红光区域发射的小分子荧光染料作为受体⁵。
表 1 汇总了所有检测技术及其特性，包括激发峰和发射峰。除上述列出的特性外，这些试剂盒的时间间隔和检测窗口也存在差异。
表 1：主流 TR-FRET 检测试剂盒及其激发峰、发射峰对比
| 试剂盒 | 供体 | 笼状结构类型 | 激发波长 | 供体发射波长 | 受体 | 受体发射波长 |
| LANCE | 铕 | 螯合物 | 320 nm | 620 nm | ULightTM | 665 nm |
| LANCE | 铕 | 螯合物 | 320 nm | 620 nm | Surelight® APC | 665 nm |
| LanthaScreen Eu | 铕 | 螯合物 | 320 nm | 620 nm | AlexaFluor 647 | 665 nm |
| LanthaScreen Tb | 铽 | 螯合物 | 340 nm | 490 nm | 荧光素/GFP | 520 nm |
| HTRF Red（Eu） | 铕 | 穴状化合物 | 320 nm | 620 nm | XL665/d2 | 665 nm |
| HTRF Red (Tb) | 铽 | 穴状化合物 |
340 nm | 620 nm | XL665/d2 | 665 nm |
| HTRF Green (Tb) | 铽 | 穴状化合物 | 340 nm | 620 nm | 荧光素/GFP | 520 nm |
| Transcreener TR-FRET |
铽 | 螯合物 | 340 nm | 620 nm | HiLyte647 | 665 nm |
| THUNDER | 铕 | 螯合物 | 620 nm | 620 nm |
试远红染料 |
除采用商业化试剂盒外，在满足光谱匹配条件的前提下，TR-FRET 的供体与受体荧光对亦可进行灵活组合。具体而言，只要供体的发射光谱与受体的激发光谱之间具有充分的重叠，即可实现有效的共振能量转移。例如，在应用说明 AN 388《Δ9 - 四氢大麻酚衍生物与 1 型大麻素受体（CB1）的差异性结合》 中，即展示了基于自定义荧光对的 TR-FRET 检测策略。
TR-FRET 酶标仪
TR-FRET 检测通常依赖多功能酶标仪平台实现。其基本配置包括稳定的激发光源、用于波长选择的激发与发射滤光系统，以及高灵敏度检测器（如光电倍增管，photomultiplier tube, PMT）。 此外，TR-FRET 酶标仪还需支持双发射通道的信号采集，以实现供体与受体信号的同步或顺序检测。鉴于 TR-FRET 技术广泛应用于高通量筛选（HTS），相关仪器通常需兼容高密度微孔板格式，如 384 孔及 1536 孔板，以满足大规模样本分析的需求。
光源
在 TR-FRET 检测体系中，镧系螯合物或穴状配合物的激发波长通常位于 320–340 nm 范围内。因此，可采用氙气闪光灯（xenon flash lamp）或特定波长的脉冲激光器作为激发光源。相比传统宽光谱光源， TRF激光器能将更多能量聚焦于该特定波长范围，从而获得更优结果，可更好地区分低信号与高信号。
PHERAstar FSX 配备频率为 60 Hz 的 TRF 激光光源，在高通量检测中展现出显著的性能优势。该仪器可在约 36 秒内完成一块 1536 孔微孔板的检测，同时在细胞及生化检测中均可实现 Z' 因子大于 0.8，表明其具有优异的检测稳定性与数据质量（图 7）。 详情请查看《在 1536 孔板中进行的细胞及生化 HTRF 检测》。
《在 PHERAstar FSX 上进行的 THUNDER™ TR-FRET 细胞因子检测的优异性能》中显示，配备 TRF 激光器的 PHERAstar FSX 相较于同类高通量筛选酶标仪，在检测灵敏度及动态范围方面均表现出显著提升。
专用检测器
PHERAstar FSX 酶标仪配备了用于 TR-FRET 检测的光子计数检测器（PMTs）。与传统积分式检测方式（即对一定时间窗口内的荧光信号进行积分）不同，光子计数 PMT 能够对单个光子事件进行逐一记录，从而重建镧系供体荧光的时间衰减曲线。这种检测模式不仅提高了弱信号检测能力，还为时间分辨参数优化提供了更精细的数据基础。
在 PHERAstar FSX 酶标仪上，光子计数检测能够以2 μs 的时间分辨率进行检测并形成发射衰变曲线。这种被称为 “衰变曲线监测” 的独特功能简化了检测方法的开发，有助于优化时间参数，从而提升检测性能并降低背景信号。结合积分向导（Integration Wizard），该策略为 TR-FRET 检测优化提供了系统化的支持。
双通道检测
TR-FRET 检测需要对供体与受体两个发射波长进行采集，可通过顺序检测或同步检测两种方式实现。传统酶标仪多采用顺序检测模式，即依次测量两个发射通道信号，但该方式在通量与数据一致性方面存在一定局限。
PHERAstar FSX 酶标仪的同步双发射（SDE）检测系统采用两个匹配的PMT，可并行测量两个发射波长。同步双通道检测通过两个匹配的 PMT 实现并行采集，不仅可显著缩短检测时间、提高通量，还可减少由加样差异、浓度波动或激发光不稳定引起的信号偏差，从而降低变异系数并提升数据可靠性。最终通过对两个发射信号进行比率计算，实现对分子相互作用的准确、归一化定量分析。
TR-FRET 检测的微型化
在药物筛选领域，检测微型化是提升通量与降低成本的关键策略，其核心在于在减少反应体积的同时，维持方法的可重复性、可靠性与稳健性。当前，TR-FRET 检测已可扩展至 3456 孔板规格，但在实际应用中，384 孔与 1536 孔板仍为最常用的规格。 得益于 TR-FRET 信号主要依赖于示踪剂浓度而非其绝对用量，该技术在缩小反应体系时仍能够保持稳定的信号输出与优异的数据一致性。
此外，高灵敏度检测平台（如 PHERAstar FSX 酶标仪）进一步推动了 TR-FRET 检测的微型化进程。 在学术讲座 "成功缩小筛选测定的规模：Servier的经验" 中，我们展示了一个案例研究：PHERAstar FSX 酶标仪极大地推动了 HTRF 检测从 384 孔板到 1536 孔板的微型化进程。在该平台上，HTRF 检测可由 384 孔板成功微型化至 1536 孔板，并结合试剂稀释与“即时检测”（单次激发）策略，在显著降低试剂消耗与检测时间的同时，仍可获得高质量的Z' 因子。
激酶活性检测
激酶活性通常通过检测底物的磷酸化水平变化进行评估。如参考文章《采用 THUNDER™ TR-FRET 细胞激酶免疫检测法分析 ERK1/2、p38αβγ 和 STAT3 的磷酸化》中所示。TR-FRET 还可采用竞争性检测策略，通过监测反应产物（如 ADP）的生成来间接反映激酶活性。此外，另一类常用方法是将荧光标记的激酶底物与镧系元素标记的抗磷酸化抗体相结合，通过能量转移信号变化实现检测。 （图 8），如参考文章《LanthaScreen TR-FRET 酪氨酸激酶和蛋白激酶 C 检测》中所示。也可拓展至蛋白酶活性及泛素化等相关酶促反应的研究，为多种信号转导过程的定量分析提供通用技术手段。 有关激酶活性检测的更多信息，请查看《激酶检测》。
G蛋白偶联受体（GPCRs）
G 蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors, GPCRs）的研究通常可分为机制性检测与功能性检测两大类。功能性检测主要侧重于对细胞内次级信使的定量分析，如肌醇单磷酸（IP1）或环磷酸腺苷（cAMP）。在受体激活或特定抑制剂作用下，这些次级信使可在细胞内发生积累，其浓度变化与配体结合及受体激活程度密切相关。因此，次级信使常作为检测读数，用于评估 GPCR 的功能活性。
如参考文章《用于功能筛选的 HTRF IP-One 检测》和《采用 Cisbio 公司的 cAMP 和 IP1 HTRF HTplex 细胞检测法测量 GPCR 激活》所示，机制性检测聚焦于受体在细胞膜上的结构组织状态及其相互作用模式，例如受体的二聚化或寡聚化过程，这些结构变化是信号转导的重要基础。
生物标志物
对信号转导通路下游产物的定量分析，是识别神经系统疾病、代谢性疾病及炎症相关疾病中异常调控机制的重要手段。TR-FRET技术可在复杂生物体系中实现对关键生物标志物的高灵敏度检测，从而用于评估针对相关疾病的特异性化合物的药效与作用机制。 典型应用包括代谢性疾病（如Ⅱ型糖尿病）研究的《快速 HTRF 胰岛素检测的开发》、用于神经退行性疾病研究的《人 tau 蛋白聚集的检测》，以及《在 PHERAstar FSX 上进行的 THUNDER™ TR-FRET 细胞因子检测的优异性能》中针对不同疾病细胞因子的定量分析。
TR-FRET 技术亦可应用于基于功能读数的药物筛选策略。 参考文章《靶向 1 型胆囊收缩素受体筛选新型肥胖治疗药物》中，展示了如何利用 TR-FRET 检测筛选 IP₃ 的下游代谢产物肌醇单磷酸（IP1）的积累，并基于该功能性读数进一步开发 TR-FRET 结合检测方法，从而实现对受体活性及分子相互作用的综合评估。
结合动力学事件分析
由于实验复杂度较高且通量相对有限，配体–受体结合动力学研究在传统药物研发流程中通常位于后期阶段。然而，对结合动力学参数的优化对于药物开发具有重要意义。结合速率（kon）与解离速率（koff）直接影响药物的作用效力、持续时间以及潜在副作用发生率，同时也与受体偏向性激动（biased agonism）等功能特性密切相关。因此，在进入体内模型及临床研究之前，于早期筛选阶段对候选化合物的结合动力学特征进行系统评估至关重要。
基于 TR-FRET 的检测技术可用于高效开展结合动力学研究（图 9）。配备动力学检测功能的多功能酶标仪能够实现对结合与解离过程的实时监测，适用于高通量筛选及低亲和力化合物的动力学分析。例如《测量配体 - 受体结合动力学的 TR-FRET 方法及其在片段筛选中的应用》和《采用 HTRF 分析结合动力学》均展示了 TR-FRET 在动力学参数解析及片段筛选中的应用潜力。
