荧光偏振检测 | BMG LABTECH

荧光偏振（Fluorescence Polarization, FP）是一种基于荧光信号偏振特性的检测技术，广泛用于监测溶液中分子间相互作用。不同于荧光强度检测仅对特定波长下的发射光强度进行量化且不涉及偏振信息，荧光偏振技术通过分析不同偏振方向的发射光强度差异，并以此作为检测输出，从而实现对分子行为的表征。

该技术常用于评估生物分子相互作用（如蛋白质-蛋白质结合、蛋白质-DNA 结合）及酶活性，在基础研究与高通量筛选中已得到广泛应用。

荧光偏振最初主要应用于诊断领域。直至20世纪60年代，首个荧光偏振免疫分析方法被提出。在生命科学研究的早期阶段，由于缺乏高灵敏度检测仪器，其应用受到一定限制。随着现代酶标仪在检测性能与灵敏度方面的显著提升，荧光偏振技术得以提供更高可靠性的数据输出，同时具备更高的数据可靠性和更宽的检测窗口，在当前生物学研究中得到广泛应用。

荧光偏振的原理

光是一种电磁波，其电场振动方向与传播方向垂直。非偏振光（未偏振光）的电场振动方向会随时间随机变化，常见光源如太阳光、传统白炽灯及卤素灯均属于此类。

当光通过特定偏振滤光片后，其电场振动方向被限制在单一平面内，此时所有通过的光波将在同一方向上振动，形成平面偏振光（即偏振光）。激光器是实验中最常见的偏振光光源。相较而言，非偏振光可视为由多个不同偏振方向的光波叠加而成，不存在主导的偏振态（图1）。

根据电场振动形式的不同，偏振光可分为线偏振光、圆偏振光和椭圆偏振光。其中，线偏振光的电场仅在与传播方向垂直的单一平面内振动，是生命科学研究中应用最为广泛的偏振类型，也是本文的重点讨论对象。

在光的反射与透射过程中，最具实际意义的两种线偏振态分别为平行偏振（p 偏振，电场方向平行于入射面）与垂直偏振（s 偏振，电场方向垂直于入射面），这两种偏振态构成了荧光偏振检测中信号解析的基础。

荧光偏振检测的理论基础

荧光偏振检测基于稳态荧光检测的通用理论（详见荧光强度相关页面），同时其测量原理依赖两个关键：其一，荧光团的偏振程度与其分子翻滚速率呈负相关；其二，荧光团在不同偏振方向（通常为相对于激发光平行与垂直方向）上的发射光强存在差异。

当平面偏振光激发小分子（分子量 < 1.5 kDa）且未与靶标结合的荧光分子（示踪剂）时，由于其在溶液中具有较高的旋转自由度，在激发态寿命内可发生快速各向旋转，导致发射光在不同偏振方向上被平均化，表现为近似非偏振光。

相反，当该荧光分子与大分子（分子量 > 10 kDa）结合后，复合物体积显著增加，其旋转扩散速率降低，在激发态寿命内分子取向变化受限，从而使发射光保持与激发光相似的偏振方向，表现为较高的偏振信号（图2）。

荧光偏振的定量计算

荧光偏振本质上反映了示踪剂在“激发—发射”时间尺度内的分子旋转行为，其定量表达如下：

P = (F|| - F⊥ )/(F|| + F⊥ )

其中，F|| 表示与激发光偏振方向平行的发射荧光强度，F⊥表示与其垂直方向的发射荧光强度。该比值用于表征发射光的偏振程度，从而间接反映分子在溶液中的旋转扩散特性¹ 。

从定量角度看，荧光偏振值（P）定义为平行与垂直方向荧光强度差占总荧光强度的比例。该参数为无量纲量，通常以毫偏振单位（mP）表示，其中 1 P = 1000 mP。理论上，P 值的取值范围为 -330 至 500 mP，但在实际生物分析中极少达到该极限。典型实验数据通常分布在 10–300 mP 范围内（例如图3），该区间可提供良好的检测灵敏度与动态范围，适用于多数分子相互作用与酶活性分析场景。

荧光偏振与各向异性

“各向异性”（Anisotropy）概念最早于20世纪60年代提出，主要用于描述荧光发射的偏振特性。其定量表达如下：

r = (F|| - F⊥)/(F|| + 2 F⊥)

其中， F|| 表示垂直偏振激发光经垂直偏振片筛选后的发射光强度。F⊥表示在垂直偏振激发、水平偏振检测条件下获得的发射光强度 ²。

从数学关系上看，荧光偏振（P）与各向异性（r）之间可相互转换，二者均由不同偏振方向的发射光强推导得到，本质上反映的是荧光分子在结合态与游离态之间的平均取向与旋转行为。因此，在大多数应用场景中，两者所包含的信息是等价的³。

在术语使用上，“荧光偏振”更常用于描述整体检测技术体系，尤其是在临床化学与应用导向场景中；而“各向异性”则更常见于生物物理学与生物化学研究领域，具体选择通常取决于应用背景及学科习惯。

荧光偏振如何检测？

荧光偏振检测通常通过酶标仪完成，其整体流程与荧光强度检测类似，但在光路设计上引入了偏振元件，以实现对不同偏振方向信号的区分与测量。

在检测过程中，样品首先由特定波长的偏振激发光照射，通常采用氙灯或卤钨灯作为光源，其发出的宽谱白光经滤光片或光栅进行光谱过滤。通过激发偏振片将光的电场振动方向限定在单一平面，从而形成线偏振光并作用于样品。

自然光的电场矢量可沿相对于传播方向的任意方向振动。偏振片本质上是一种能够筛选电场振动方向的光学元件。置于激发光路中的偏振片可使特定方向（通常定义为平行方向）的偏振光透过，同时阻挡垂直方向分量，从而实现对激发光偏振态的控制。

样品发射的荧光信号首先经滤光片或光栅进行光谱纯化，以去除杂散光干扰。随后，在样品与检测器之间设置发射偏振片，根据发射光相对于激发光偏振面的方向，将其分离为平行（F||）与垂直（F⊥）两个分量。该发射偏振片通常与激发偏振片类型一致。。最终，两个偏振面的光强度由检测器（通常为光电倍增管，PMT）进行定量。

两种偏振分量需分别获取：最基础的方式是通过两次顺序测量完成——首先记录平行偏振信号，随后将发射偏振片旋转90°，测量垂直偏振信号（图4）。

得益于同步双发射检测技术，像 PHERAstar FSX 可通过同步双发射检测技术同时采集两个偏振方向的信号。该策略不仅显著提升检测效率，还可有效降低顺序测量带来的系统误差，从而提高数据的重复性与可靠性。

荧光偏振检测的注意事项

在荧光偏振检测中，一般不推荐使用光栅作为波长分离元件。由于光栅存在透射率较低且背景杂散光较高的问题，容易引入额外噪声，从而增加检测变异性，并对检测窗口范围及结果稳定性产生不利影响。

在紫外波段检测中，读数仪必须配备氙灯作为激发光源。卤钨灯由于在400 nm以下波长范围内输出强度较弱，不适用于紫外检测条件。同时，还需使用专用紫外偏振片，因为常规偏振片在紫外波段的透射效率较低，会显著削弱信号强度。

在信号解释方面，低偏振值（P）通常表明荧光分子处于游离状态，在溶液中具有较高的自由旋转能力；而高偏振值则提示分子形成较大复合物，其旋转运动受限。尽管生物分析中的典型测量范围约为10–300 mP，但借助高性能多功能酶标仪，例如PHERAstar FSX 或 CLARIOstar Plus 等高端多功能酶标仪可以实现高精度测量，其标准偏差可控制在 ±0.5 mP 以内，从而显著提升实验重复性与数据可靠性。

荧光偏振实验用荧光团

在荧光偏振（FP）实验中，荧光染料的选择具有关键作用。理想荧光团的激发与发射光谱应与体系中其他组分尽量区分，以降低自发荧光干扰；同时需具备较大的斯托克斯位移，从而减轻光散射对信号的影响。此外，荧光团应便于与示踪分子进行化学偶联，但不能显著影响示踪剂的分子翻滚行为或干扰其相互作用过程。同时，其还需具备较高量子产率（即较强发光效率），并具有良好的化学稳定性与光稳定性，以保证检测信号的可靠性与重复性。⁴

在传统应用中，最常用的荧光团为异硫氰酸荧光素（FITC）及其光谱特性相近的染料。然而，随着现代酶标仪检测灵敏度的提升，Cy3B、Cy5 等红色荧光染料的应用逐渐增多。检测性能的优化使得其相对较低的光子产率不再成为主要限制因素。相较于蓝绿光区染料，红色荧光团具有明显优势：能够有效降低来自生物样品的自发荧光背景，从而减少假阴性结果的发生，同时也可降低光散射造成的信号干扰，减少假阳性风险。⁵

荧光偏振的优势

在用于研究分子结合事件的各类检测方法中，荧光偏振（FP）具有独特优势。该技术基于单一荧光标记策略，无需额外分离步骤，因此实验流程更为简化。相较于传统方法，这不仅减少了试剂用量，且通常降低整体实验成本。此外，由于检测过程不破坏样品体系，只要 pH、温度及黏度保持稳定，样品通常可进行重复测量。

荧光偏振能够直接、实时监测溶液中示踪分子的游离与结合比例，可对极低浓度样品（通常低至皮摩尔级）进行平衡分析。同时，由于具备实时检测能力，该技术不仅适用于平衡态研究，还可用于结合与解离动力学过程的分析。

作为一种均相检测技术，荧光偏振采用“混合即读”（mix-and-read）的简化流程，无需区分并分离结合态与游离态分子，从而减少操作步骤对体系的干扰，使结合事件的定量更加真实可靠。需要注意的是，其他均相检测方法（如 FRET、TR-FRET 或 AlphaScreen^® ）通常除示踪剂标记外，还需额外引入第二标记体系，而荧光偏振无需此类附加标记。

此外，荧光偏振基于强度比值的测量方式可有效消除化合物吸光或荧光淬灭带来的系统误差，并支持实验微量化操作。这些特性共同使其在高通量筛选应用中具有显著优势，并得到广泛使用。

荧光偏振的局限性

尽管荧光偏振（FP）具有操作简便与高灵敏度等优势，但该技术仍存在一定应用限制。其信号变化依赖于分子旋转速率差异，因此通常需要显著的分子体积变化才能产生足够的信号变化与检测窗口。在理想的FP结合实验中，应监测小分子与大分子之间的相互作用，并优先对分子量较小的一方进行荧光标记。常见示踪剂包括小肽、小蛋白质、细胞因子及小分子化合物等，这类设计能够在结合前后形成最大分子体积差异，从而获得更大的信号变化范围。相反，FP方法通常不适用于两种大分子蛋白之间的相互作用检测。

此外，化合物的自发荧光及光散射效应可能对检测结果产生干扰，进而导致假阳性或假阴性信号。因此，通常建议在加入荧光标记探针前先测定孔中的背景荧光，并在数据分析过程中进行扣除，以提高结果准确性。由于自发荧光在较长波长区域通常较弱，因此采用红色荧光染料（如 BODIPY TMR 或 Cy5）可有效降低背景干扰，从而改善信噪比并减少非特异性信号影响⁶^,⁷。

应用领域：荧光偏振结合实验

荧光偏振（FP）结合实验可用于分析多种分子相互作用及解离过程，包括蛋白质–配体、肽–蛋白质、蛋白质–DNA 相互作用，以及原纤维前体蛋白的聚集行为。此外，该方法还可用于识别干扰化合物与非特异性抑制剂，从而提高筛选结果的可靠性。

除结合分析外，荧光偏振还可拓展至多种功能性研究场景，例如用于评估脂质体或线粒体膜体系中的膜流动性；以及开展实时酶促反应分析，包括蛋白水解、RNA 合成及结合动力学研究。此外，该技术亦适用于泛素化及去泛素化过程的实时监测（图 5）。在靶向蛋白降解研究中，荧光偏振可用于解析基于PROTAC或分子胶策略的作用机制，包括其与靶蛋白的结合活性及相互作用动力学。同时，该方法还可用于监测由已知降解子与E3连接酶之间特异性相互作用所触发的靶蛋白降解过程，从而为相关药物研发提供定量化工具支持。

小分子筛选中的荧光偏振实验

20 世纪 90 年代，荧光偏振（FP）技术被引入药物筛选领域，用于加速药物研发进程。凭借其均相、快速且可定量的特点，荧光偏振已成为筛选实验室中的常规工具。由于荧光偏振值通常与示踪剂的结合/游离比例呈线性相关，因此常用于测定候选化合物的IC50值。

在药物研发过程中，荧光偏振实验已广泛应用于多类靶点研究，如 G 蛋白偶联受体（GPCRs）、激酶、磷酸酶以及蛋白酶等。在分子相互作用研究中，荧光偏振通常通过分子体积增加所引起的偏振信号升高来指示结合事件；而在解离实验或酶促降解体系中，则通过分子体积减小导致的偏振信号降低进行监测。

在高通量筛选（HTS）应用中，荧光偏振主要用于两类分析：一是直接分子相互作用检测，二是酶促反应过程分析。依托高灵敏度与高通量兼容的酶标仪平台，可对多种靶点的小分子进行高效筛选。例如，该技术已被用于泛素化调控相关因子及抗癌靶点 CSN5 抑制剂的筛选，以及H-前列腺素D合酶抑制剂的筛选等研究

同源 FRET 荧光偏振

FRET是研究分子相互作用的常用方法。通常情况下，体系中的两个相互作用分子分别标记不同荧光团（供体与受体）以实现能量转移检测。然而，当能量转移发生在相同类型荧光团之间时，则称为同源 FRET（homoFRET）荧光偏振（FP）技术可应用于同源FRET 研究，因为能量转移会导致发射偏振方向随机化，从而产生去偏振信号。如应用说明《利用同源 FRET-FP 检测监测活细胞中胰岛素颗粒的包装》中所述，同源 FRET-FP 可用于研究细胞内的蛋白质聚集或二聚化事件（图 6）。

荧光偏振免疫分析法（FPIA）

荧光偏振免疫分析法（FPIA）是生物化学领域中较早建立并广泛应用的检测技术之一，属于典型的竞争性免疫分析方法，可用于定量检测抗原或抗体。在荧光偏振免疫分析中，与荧光团结合的抗原被用作示踪剂。该示踪剂与另一抗原通常会竞争结合特定抗体：示踪剂与抗体的高结合率通常会产生偏振信号；而若未标记的抗原优先与抗体结合，则游离的示踪剂会产生非偏振光。这种信号变化与样品中抗原的含量呈正比。⁸

参考文献

Lakowicz JR, Principles of fluorescence spectroscopy, third edition, 2010.
Jablonski A. 1960. On the notion of emission anisotropy. Bull l’Acad Pol Sci, Ser A 8:259–264.
Mocz G. Information content of fluorescence polarization and anisotropy. J Fluoresc. 2006 Jul;16(4):511-24.
Zhang, H.; Yang, S.; De Ruyck, K.; Beloglazova, N.V.; Eremin, S.A.; De Saeger, S.; Zhang, S.; Shen, J.;Wang, Z. Fluorescence polarization assays for chemical contaminants in food and environmental analyses. TrAC Trends Anal. Chem. 2019, 114, 293–313.
Turek-Etienne TC, Small EC, Soh SC, Xin TA, Gaitonde PV, Barrabee EB, et al: Evaluation of fluorescent compound interference in 4 fluorescence po-larization assays: 2 kinases, 1 protease, and 1 phosphatase. J Biomol Screen. 2003;8:176-184.
Owicki JC. Fluorescence polarization and anisotropy in high throughput screening: perspectives and primer. J Biomol Screen. 2000;5(5):297–306.
Turek-Etienne TC, Lei M, Terracciano JS, et al. Use of red-shifted dyes in a fluorescence polarization AKT kinase assay for detection of biological activity in natural product extracts. J Biomol Screen. 2004;9(1):52–61.
Sensitive Rapid Fluorescence Polarization Immunoassay for Free Mycophenolic Acid Determination in Human Serum and Plasma. Bettina Glahn-Martínez, Elena Benito-Peña, Francesca Salis, Ana B. Descalzo, Guillermo Orellana, and María C. Moreno-Bondi Analytical Chemistry 2018 90 (8), 5459-5465.