PHERAstar FSX
功能强大，高度灵敏的HTS酶标仪
什么是时间分辨荧光？
荧光是分子在吸收短波长光激发后，由激发态返回基态过程中所发射的长波长光辐射。
荧光检测通常分为两类：稳态荧光（steady-state fluorescence）与时间分辨荧光（time-resolved fluorescence, TRF）。两者的核心区别在于所采用荧光团的光物理特性及其发射寿命差异，从而决定了信号采集的时间维度不同。
稳态荧光是最常用的检测模式，通常以“荧光强度”作为读出信号。典型有机荧光团（如荧光素、罗丹明等）在激发后，其发射寿命处于纳秒量级，激发与发射几乎同步发生，因此检测通常在连续激发条件下实时采集荧光强度信号。
相比之下，时间分辨荧光（TRF）基于荧光信号的时间衰减行为进行检测，通常采用脉冲激发并在延迟时间窗口内采集发射信号。该方法要求荧光团具有显著延长的发射寿命（通常为微秒至毫秒级），区别于传统荧光标记物的快速纳秒衰减特性。通过在激发后设定延迟检测时间，可有效避开短寿命背景荧光，从而实现高灵敏度与高信噪比的检测（见图1）。
镧系元素：时间分辨荧光的专用荧光团
镧系元素（lanthanides, Ln）是一类具有独特荧光特性的金属化学元素，常被统称为 “稀土元素”。镧系元素的吸收（激发）系数极低，发射速率缓慢，从而赋予其显著延长的荧光寿命，通常可达0.5–3毫秒。镧系元素以三价阳离子（Ln³⁺）形式存在，可在水溶液中产生稳定荧光。此外，其发射光谱呈现高度锐窄的特征峰，并具有较大的斯托克斯位移，这些性质使其在复杂生物体系中具有优异的信号分辨能力 [1]。
镧系元素具备作为生化探针的优良特性。最初，它们在生物体系中被用作钙的发光探针。早期研究中，其发光行为已被用于模拟和检测Ca²⁺结合过程，并被证明可作为蛋白质中钙离子结合位点的高灵敏指示工具。 [2]
长寿命发射特性使镧系荧光团成为时间分辨荧光（TRF）检测体系的理想选择。 在生命科学应用中，铕（Eu³⁺）、铽（Tb³⁺）、钐（Sm³⁺）和镝（Dy³⁺）最为常用，尤其在时间分辨荧光免疫分析中应用广泛，其中以铕和铽体系最为成熟和常见（见图2）。
铕离子（Eu³⁺）是时间分辨荧光免疫分析中最常用的标记物之一。 除了具有长发射荧光寿命外，铕还表现出约290 nm的大斯托克斯位移，使激发光谱与发射光谱之间几乎无重叠，从而有效降低光学串扰。此外，Eu³⁺在615 nm处具有带宽约10 nm的窄发射峰，谱线高度尖锐，有利于实现高选择性与高信噪比检测（见图3）。[3]
螯合物与穴状化合物
由于镧系离子本身的吸收系数较低，其直接激发所产生的荧光信号通常较弱，难以满足时间分辨荧光（TRF）检测的灵敏度要求。因此，在实际应用中，镧系元素被引入至具有能量传递功能的“笼状结构”中。这类结构主要包括螯合物（chelates）与穴状化合物（cryptands）。它们可高效吸收入射光能能量传递至镧系离子，从而显著增强其发射信号强度（见图4）。值得一提的是，此类复合物的激发光谱主要由配体（即“笼状结构”）决定，而非镧系离子本身的吸收特性。[4]
除信号放大作用外，螯合结构还提供了化学修饰位点，使镧系离子能够稳定偶联至各类生物分子（如抗体、受体或配体），这是构建时间分辨荧光免疫分析体系的关键基础。
![图4：荧光态钕螯合物示例。改编自[5]。](https://www.bmglabtech.com/hubfs/1_Webseite/5_Resources/ABC/Detection%20Modes/time-resolved-fluorescence-fig4.webp)
时间分辨荧光检测过程
时间分辨荧光（TRF）的检测系统在硬件构成上与常规荧光强度检测类似，主要包括光源系统、波长选择光学组件以及光电倍增管（PMT）检测器。
在光源配置方面，由于镧系元素-配体复合物的典型激发波长集中在约337 nm，TRF检测通常采用氙气闪光灯或特定脉冲激光器作为激发源。 多功能酶标仪普遍配备宽带氙灯，可兼容多种检测模式；而高端系统则可选配专用TRF激发激光器，通过在特定波长范围内提供更高能量密度，从而提升低信号检测能力及信号分辨率。然而，此类激光器因波长固定，适用范围相对有限，通常仅用于TRF相关应用。
在波长选择方面，滤光片系统与光栅单色器均可实现激发与发射光的分离。 而基于滤光片的酶标仪透光率更高，通常比光栅酶标仪灵敏度更高，更适用于光子产率有限的时间分辨荧光（TRF）检测。而基于光栅的系统虽然具备更高的波长灵活性，但在时间分辨荧光，尤其是TR-FRET等低信号检测场景中，灵敏度往往受到一定限制。
在时间分辨荧光（TRF）检测中，通常采用光电倍增管（PMT）作为高灵敏度检测器。基于镧系荧光团的长寿命发射特性，PMT在激发脉冲结束后延迟开启，使得短寿命的自发荧光信号衰减消失。随后，系统在预设的时间窗口内对发射信号进行积分采集，该过程以时间函数形式对荧光强度进行累积。该检测策略涉及两个关键参数：“积分起始时间”（delay time）与“积分时间”（integration time），通常设定在微秒量级（见图5）。
高端酶标仪还可配备用于时间分辨荧光检测的所谓光子计数光电倍增管（PMTs）。与常规积分检测不同，传统酶标仪仅在设定积分时间内输出荧光信号的累积强度（即曲线下面积），而光子计数模式则能够以时间分辨方式逐点记录光子事件，从而重建镧系荧光团的完整发射衰减曲线。
在 PHERAstar FSX 酶标仪上，光子计数检测可实现约2微秒时间分辨率的数据采集，并生成高精度发射衰减曲线。 这被称为 “衰变曲线监测”（Decay Curve Monitoring）的独特功能，可直观表征荧光寿命特征， 简化TRF方法的开发，并有助于精确优化积分起始时间与积分窗口，从而提升信号分辨能力并有效降低背景干扰。
时间分辨荧光免疫检测
时间分辨荧光（TRF）免疫检测广泛用于蛋白质、细胞因子等靶标分子的检测。该检测依赖于被荧光团标记的特异性抗体对靶标分子的识别与结合，通过对荧光信号的分析和定量，可间接获得靶标分子的相关信息。免疫检测具有定量性、高灵敏度的特点，并具备多参数检测（多重检测）的能力，适用于复杂生物体系分析。
在实验流程上， 与酶联免疫吸附试验（ELISA）类似，TRF检测通常在微孔板孔底预包被捕获抗体，加入样品孵育后，靶标分子被特异性捕获并固定于固相表面。 经洗涤去除未结合组分后，引入与镧系元素螯合物（常用为Eu³⁺）共价偶联的检测抗体，该抗体进一步与靶标分子结合，形成“夹心”复合物。再次洗涤后，体系中保留的镧系标记抗体数量与靶标分子浓度呈正比。TRF检测可采用直接检测或竞争检测模式进行。
由于以下三个原因，需要通过解离增强步骤将铕分子从抗体上的 “笼状结构” 中释放出来：第一，镧系元素的光吸收能力较弱；第二，它们难以被直接高效激发；第三，镧系螯合物与生物分子（如抗体）偶联后，其荧光发射效率显著降低。 解离过程通过加入一种常称为 “增强液” 的特定溶液来实现。该溶液不仅可促使镧系离子从原有螯合结构中解离，还能诱导其重新形成新的高效发光螯合结构。这种结构中包含镧系元素激发所需的发色团。增强液中的螯合剂 - 发色团可吸收激发光并将能量转移给镧系元素，从而显著增强发射信号的强度（图 6）。
样品由特定波长（通常为 337 nm）的光脉冲激发。检测过程采用时间门控策略：在激发后，首先等待短寿命自发荧光（纳秒至微秒级）完全衰减，随后再开启信号采集，从而选择性获取长寿命的时间分辨荧光信号。在检测阶段，发射信号于预设时间窗口内进行积分，最终以积分强度（而非完整衰减曲线）作为定量读出。由于该积分信号与分析物浓度呈正相关关系，因此可通过建立标准曲线实现准确的定量分析。
DELFIA® 是目前应用最广泛的时间分辨荧光免疫分析方法之一。
DELFIA
DELFIA（解离增强镧系荧光免疫检测法，Dissociation-Enhanced Lanthanide Fluorescent Immunoassay）是一种异相、包含洗涤步骤的时间分辨荧光检测方法，其原理和实验流程与酶联免疫吸附试验（ELISAs）相似。相较于ELISA，DELFIA通常具有更宽的动态检测范围与更高的信号稳定性，检测信号在反应完成后仍可在较长时间内保持稳定（可达数月），便于重复读取与数据复核。在仪器配置方面，DELFIA检测要求酶标仪具备时间分辨荧光检测能力，典型检测参数为激发波长约337 nm、发射波长约615 nm（对应Eu³⁺发射）。
在 DELFIA 检测中，捕获抗体首先固定于微孔板表面；加入样品孵育后，靶标分子被特异性捕获。经洗涤去除未结合组分后，引入铕标记的检测抗体形成免疫复合物。完成最终洗涤后，加入增强液使镧系离子从原有复合结构中释放，并在稳定的胶束体系中重新形成高荧光性的螯合物，从而产生可检测的强荧光信号。详情请查看《使用匹配抗体对试剂盒和 PHERAstar FSX 酶标仪在384 孔板进行时间分辨荧光（TRF）免疫检测》。
尽管 DELFIA 检测具有优异的灵敏度与方法学稳健性，但由于其流程包含多步孵育与洗涤步骤，操作周期相对较长，因此在超高通量筛选场景中的应用受到一定限制。
