PHERAstar FSX
功能强大，高度灵敏的HTS酶标仪
什么是时间分辨荧光？
荧光是分子吸收短波长光后，由激发态返回基态过程中释放长波长光的辐射现象。
荧光检测通常分为两类：稳态荧光（steady-state fluorescence）与时间分辨荧光（time-resolved fluorescence, TRF）。两者的核心区别在于所采用荧光团的光物理特性及其发射寿命差异，从而决定了信号采集的时间维度不同。
稳态荧光是最常见的检测模式，通常以“荧光强度”作为读出信号。典型有机荧光团（如荧光素、罗丹明等）的发射寿命处于纳秒量级，激发与发射过程几乎同步发生，因此通常在连续激发条件下实时采集信号。
相比之下，时间分辨荧光（TRF）基于荧光信号的时间衰减行为进行检测。该方法通常采用脉冲激发，并在设定的延迟时间窗口内采集发射信号，因此要求所使用的荧光团具有显著延长的发射寿命（通常为微秒至毫秒级），以区别于背景荧光的快速纳秒衰减。通过在激发后延迟检测，可有效避开短寿命背景信号，从而显著提高检测的灵敏度与信噪比（见图1）。
镧系元素：时间分辨荧光的专用荧光团
镧系元素（lanthanides, Ln）是一类具有独特荧光特性的金属元素，通常归属于“稀土元素”范畴。 在发光检测领域，其最显著特征在于极低的本征吸收系数与缓慢的辐射跃迁速率，从而赋予其长发射寿命，通常可达0.5–3 ms量级。镧系元素通常以三价阳离子（Ln³⁺）形式存在，并可在适当配体环境中于水溶液中产生稳定发光信号。此外，其发射光谱呈现窄带特征峰，并具有较大的斯托克斯位移，这使其在复杂生物背景中具备优异的光谱分辨能力与低背景干扰优势 [1]。
镧系元素具备作为生化探针的优良特性。早期研究中，其发光性质被用于模拟和指示Ca²⁺结合行为，作为蛋白质中钙离子结合位点的高灵敏标记工具，为其在生物检测中的应用奠定了基础 [2] 。
基于其长寿命发射特性，镧系荧光团成为时间分辨荧光（TRF）检测体系的理想选择。在实际生命科学应用中，铕（Eu³⁺）、铽（Tb³⁺）、钐（Sm³⁺）和镝（Dy³⁺）是最常用的几类，其中尤以Eu³⁺与Tb³⁺体系应用最为广泛，已成为时间分辨荧光免疫分析等高灵敏检测技术的核心标记体系（见图2）。
铕离子（Eu³⁺）是时间分辨荧光免疫分析中最常用的标记物之一。其不仅具有毫秒级的长发射寿命，还表现出约290 nm的大斯托克斯位移，使激发光谱与发射光谱几乎完全分离，从而显著降低光学串扰与背景干扰。 此外，Eu³⁺在615 nm处具有带宽约10 nm的窄发射峰，谱线高度尖锐，有利于实现高选择性的信号采集与优异的信噪比表现。 （见图3）。[3]
螯合物与穴状化合物
由于镧系离子本身的吸收系数较低，其直接激发所产生的荧光信号通常较弱，难以满足时间分辨荧光（TRF）检测的灵敏度要求。因此，在实际应用中，通常将镧系元素引入具有能量转移功能的配位结构中，以提高其发光效率。这类结构主要包括螯合物（chelates）与穴状化合物（cryptands）。它们可高效吸收外界激发能量，并将能量转移至中心镧系离子，从而显著增强其特征发射信号（见图4）。值得一提的是，此类复合物的激发光谱主要由配体（即“笼状结构”）决定，而非镧系离子本身的吸收特性。[4]
除信号放大作用外，螯合结构还提供了化学修饰位点，使镧系离子能够稳定偶联至抗体、受体或配体等多种生物分子。这一特性是构建时间分辨荧光免疫分析体系的关键基础。
![图4：荧光态钕螯合物示例。改编自[5]。](https://www.bmglabtech.cn/hubfs/1_Webseite/5_Resources/ABC/Detection%20Modes/time-resolved-fluorescence-fig4.webp)
时间分辨荧光检测过程
时间分辨荧光（TRF）的检测系统在硬件构成上与常规荧光强度检测类似，主要包括光源系统、波长选择光学组件以及光电倍增管（PMT）检测器。
在光源配置方面，由于镧系元素-配体复合物的典型激发波长集中在约337 nm，TRF检测通常采用氙气闪光灯或脉冲激光作为激发光源。 多功能酶标仪普遍配备宽带氙灯，可兼容荧光、吸光度及发光等多种检测模式；而高端系统则可选配专用TRF激发激光器，在特定波长范围内提供更高能量密度，从而提升低信号检测能力及检测灵敏度。但由于激光器波长固定，其适用范围相对有限，通常专用于TRF及相关高灵敏检测应用。
在波长选择方面，激发光与发射光的分离可通过滤光片系统或光栅单色器实现。相较而言，滤光片系统具有更高的光透过率，因此在光子产率较低的时间分辨荧光检测中通常表现出更高灵敏度。而光栅单色器虽然具备更高的波长可调性，但在TRF及TR-FRET等低信号应用中，由于光通量损失较大，其灵敏度通常受到一定限制。
在时间分辨荧光（TRF）检测中，通常采用光电倍增管（PMT）作为高灵敏度检测器。基于镧系荧光团的长寿命发射特性，PMT在激发脉冲结束后延迟开启检测窗口，使短寿命的自发荧光信号在检测开始前充分衰减，从而实现有效的时间分辨与背景抑制。随后，系统在预设的时间窗口内对发射信号进行积分采集，该过程以时间函数形式对荧光强度进行积分。该检测策略涉及两个关键参数：“积分起始时间”（delay time）与“积分时间”（integration time），通常设定在微秒量级（见图5）。
高端酶标仪还可配备用于时间分辨荧光检测的所谓光子计数光电倍增管（PMTs）。与传统积分检测方式不同，常规酶标仪通常仅在设定积分时间内输出荧光信号的累积强度（即时间窗口内的总光子计数或曲线积分值），而光子计数模式则能够以时间分辨方式逐点记录单个光子事件，从而重建镧系荧光团完整的发射衰减曲线。
在 PHERAstar FSX 酶标仪上，光子计数检测可实现约2 μs时间分辨率的数据采集，并输出高精度的荧光衰减曲线。这一功能被称为“衰变曲线监测”（Decay Curve Monitoring），可直观表征荧光寿命特征， 简化TRF方法的开发，并有助于精确优化积分起始时间与积分窗口，从而提升信号分辨能力并有效降低背景干扰。
时间分辨荧光免疫检测
时间分辨荧光（TRF）免疫检测广泛应用于蛋白质、细胞因子及其他生物标志物的高灵敏定量分析。该方法基于荧光团标记的特异性抗体对靶标分子的高亲和力识别与结合，通过检测时间分辨荧光信号，实现对目标分子的间接定量分析。该技术具有较高的灵敏度与定量能力，并具备多重检测能力，适用于复杂生物体系的分析需求。
在实验流程上， 与酶联免疫吸附试验（ELISA）类似，TRF检测通常在微孔板孔底预包被捕获抗体。加入样品后，目标分子被特异性捕获并固定于固相表面。随后通过洗涤步骤去除未结合成分，再加入与镧系螯合物（常以Eu³⁺为代表）共价偶联的检测抗体，该抗体进一步与靶标分子结合，形成典型的“夹心结构”复合物。再次洗涤后，体系中保留的镧系标记抗体量与靶标分子浓度呈正相关，从而实现定量分析。TRF免疫检测既可采用直接检测模式，也可采用竞争检测模式，以适应不同类型抗原及结合体系的分析需求。
时间分辨荧光免疫检测中通常需要通过“解离-增强”步骤将铕离子从抗体偶联的原始“笼状结构”中释放并重新配位，其原因有以下三点：第一，镧系离子本身光吸收截面较低；第二，其直接激发效率有限；第三，当镧系螯合物与生物大分子（如抗体）偶联后，其发光效率通常进一步下降。
解离过程通过加入一种常称为 “增强液” 的特定溶液来实现。该试剂不仅能够促使镧系离子从原有螯合配位环境中解离，还会诱导其在溶液中重新形成具有高发光效率的二次螯合结构。新的配位结构可有效吸收激发光能，并通过分子内能量转移将能量传递至镧系离子，从而显著增强其特征发射信号强度（图6）。
样品由特定波长（通常为 337 nm）的光脉冲激发。整个检测采用时间门控策略：在激发结束后，系统首先设置延迟时间，使纳秒至微秒量级的短寿命自发荧光充分衰减；随后开启检测窗口，仅采集长寿命镧系荧光信号，从而实现对目标信号的选择性提取。在信号采集阶段，发射光于预设时间窗口内进行积分，并以积分强度作为最终读出值，而非记录完整的衰减曲线。由于该积分信号与分析物浓度呈线性相关，因此可通过标准曲线实现定量分析
DELFIA® 是目前应用最广泛的时间分辨荧光免疫分析方法之一。
DELFIA
DELFIA（解离增强镧系荧光免疫检测法，Dissociation-Enhanced Lanthanide Fluorescent Immunoassay）是一种典型的异相时间分辨荧光检测体系，包含标准洗涤步骤，其基本原理与酶联免疫吸附试验（ELISA）类似。相较于ELISA，DELFIA通常具有更宽的动态范围与更高的信噪比，并且在反应结束后信号可长期保持稳定（可达数月），便于重复读取与数据验证。在仪器要求方面，DELFIA检测需要配备时间分辨荧光检测功能，典型参数为激发波长约337 nm、发射波长约615 nm（Eu³⁺特征发射）。
在 DELFIA 检测中，捕获抗体首先固定于微孔板表面；加入样品孵育后，靶标分子被特异性捕获并富集于固相表面。经洗涤去除未结合组分后，引入铕标记的检测抗体形成免疫复合物。完成最终洗涤后加入增强液，使镧系离子从原始螯合环境中解离，并在溶液中重新形成高效发光的配位复合物，从而产生强时间分辨荧光信号。相关实验流程可参考《使用匹配抗体对试剂盒和 PHERAstar FSX 酶标仪在384 孔板进行时间分辨荧光（TRF）免疫检测》。
尽管 DELFIA 检测具有优异的灵敏度与方法学稳健性，但由于其依赖多步孵育与洗涤流程，整体操作时间较长，因此在超高通量筛选应用中存在一定限制。
