PHERAstar FSX
Powerful and most sensitive HTS plate reader
什么是 TR-FRET？
时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）是一种将时间分辨荧光（TRF）与福斯特共振能量转移（FRET）的检测技术。TR-FRET 主要用于分析结合事件及高通量药物筛选。
福斯特共振能量转移描述了两个荧光团之间的能量转移过程，该技术以首次提出共振能量转移理论的德国科学家Theodor Förster命名 ¹。能量转移发生的条件是：供体荧光团受激发吸收能量后处于电子激发态，随后将能量转移至第二个受体荧光团。能量转移会导致供体的发射强度降低，同时使受体的发射强度升高。
能量转移需满足两个条件：首先，供体与受体之间的空间距离需处于 20-90 Å范围内。共振能量转移与供体到受体距离的六次方成反比，因此对距离变化极为敏感；其次，供体的发射光谱与受体的激发光谱必须存在重叠。“荧光共振能量转移对（FRET pairs）” 的发射峰之间必须有足够的间距，以便实现光学区分，同时又需有足够的光谱重叠以保证能量的高效转移（图 1A）。
在生物学研究中，基因编码荧光蛋白的应用最为广泛，其中最常用的包括绿色荧光蛋白（GFP）、红色荧光蛋白（RFP）、青色荧光蛋白（CFP）和黄色荧光蛋白（YFP）²。
FRET 通常用于研究分子相互作用或结合事件，也可用于测定两个结合伴侣的结合亲和力。具体操作是将待研究的每个结合伴侣与荧光团相连，通过检测发生的能量转移水平来进行分析评估（图 1B、C）。不过，标准 FRET 会受到激发光散射和自发荧光产生的背景信号干扰，因此难以通过该方法获得高灵敏度的检测结果
TR-FRET 原理
借助时间分辨荧光技术和延时检测手段，时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）能够消除激发光散射和自发荧光产生的短暂背景信号。这得益于将镧系元素用作供体，这类荧光团具有较大的斯托克斯位移，发射寿命可长达毫秒级。
TR-FRET依赖的是镧系元素与短寿命荧光团在靠近时发生的共振能量转移。基于这些特性，相较于标准FRET，TR-FRET具有更高的稳定性和特异性。供体与受体两种发射波长的长寿命荧光特性及比率检测方式，显著降低了缓冲液或培养基的干扰。
不同试剂盒制造商所采用的技术应用原理基本一致，其中最知名的制造商包括 HTRF®、LANCE®、LanthaScreenTM 和THUNDERTM。 供体和受体要么与相互作用的伴侣共价结合，要么针对两个靶标（或标签）的特异性抗体分别标记供体或受体。激发供体后，若靶标处于近距离状态，能量将通过荧光共振能量转移传递至受体，使受体发出荧光。检测到输出信号与结合事件的发生量呈正比。
TR-FRET 技术
在 TR-FRET 中，不同制造商使用的荧光团种类及荧光对各有不同。
- 供体镧系元素主要为铕（Eu）或铽（Tb）（图 2）。由于铕离子和铽离子本身荧光较弱，需嵌入聚光的“笼状结构” 中才能发光。螯合物（Chelates）和穴状化合物（cryptates）可实现这一功能，它们既能收集能量，又能传递能量。与铕相比，铽的量子产率要高出10-20 倍，摩尔消光系数（与分子吸光度相关）也更高，这两项特性均能提升筛选性能 ³。据称，螯合物 / 穴状化合物-镧系元素复合物在多种化学条件下均具有极高的稳定性，且不会像传统荧光团那样发生光漂白。
- 受体是在绿色和红色光谱范围内发射荧光的常规荧光团。为了实现共振能量转移，红色荧光团可与铕或铽搭配使用，而绿色荧光团通常与铽搭配。
TR-FRET 检测
镧系元素的激发波长通常为 320-340 nm。铕的发射波长通常在 620 nm 处检测，而铽的发射波长则根据试剂盒和制造商的不同，可在 490 nm 或 620 nm 处检测。受体方面，绿色荧光团的发射波长为 520 nm，红色荧光团的发射波长为 665 nm。供体的发射信号用作内部参照，而受体的发射信号则是能量转移（结合事件）发生的指标（图 3）。
在激发与荧光检测之间，会设置微秒级的时间延迟，这样可以消除非特异性的短寿命背景荧光。随后通常在微秒级的时间段（检测窗口）内检测发射信号（图 4）。时间延迟和检测窗口的设置会因试剂盒和制造商的不同而有所差异。
然后计算两个发射通道随时间变化的积分信号比值。这种比率检测方式可对信号进行归一化处理，消除培养基干扰和猝灭效应，并校正液体处理误差或孔间差异。
TR-FRET 的优势
高灵敏度和多功能性使 TR-FRET 检测被广泛应用。时间分辨检测与比率检测相结合，显著扩大了检测窗口并降低了背景信号。此外，镧系元素的发射信号几乎不会发生光漂白，具有良好的时间稳定性，且与多种试剂及实验条件兼容。
尽管具备上述诸多优势，该方法最主要的优点在于：检测结合对时无需将其与未结合成分进行物理分离即可降低背景干扰。作为一种均相检测技术，TR-FRET 无需中间洗涤步骤，是简单的 “加样-读数” 检测方法（图 5），最大限度地减少了操作步骤，比酶联免疫吸附试验（ELISAs）更便捷、耗时更短。因此，它特别适用于自动化高通量筛选（HTS）研究。
然而，该技术也存在局限性：外部因素与分子内激发过程的相互作用，或文库化合物、生物蛋白的荧光特性，均可能产生信号猝灭 ³。
不同的 TR-FRET 试剂盒
多家制造商均提供 TR-FRET 检测试剂盒。尽管所有检测均基于相同的核心技术，且均可通过酶标仪检测，但不同试剂盒和制造商之间仍存在差异，主要体现在供体和受体的类型、组合方式以及检测启动时间和检测窗口的设置上。
- HTRF：均相时间分辨荧光（HTRF）技术采用四种特定荧光团，可组成不同的荧光对。镧系元素供体为铕或铽穴状化合物。受体为红色荧光发射团：第一代 XL665（源自红藻纯化的色素）和第二代 d2（与 XL665 类似但分子更小）。这两种受体均可与任意一种穴状化合物供体搭配。此外，铽还可与绿色荧光团组合，从而实现多重检测（图 6）。
- LANCE：镧系螯合物激发（LANCE）技术是一种基于铕螯合物和两种不同受体分子（Surelight® APC 与 ULight™）的 TR-FRET 技术。其中 ULight™是第二代改良荧光团，分子量更小（<800 道尔顿）。
- LanthaScreen：LanthaScreen 最初以铕与别藻蓝蛋白（APC）或 Alexa Fluor647 为基础，后经优化采用铽与荧光素或 GFP 作为荧光对。铽的使用提升了检测的灵活性。由于 APC 分子量较大（>100 kDa），通常以链霉亲和素偶联物的形式存在，并以三分子复合物形式与生物素化底物结合。铽与荧光素或 GFP 组合时，可直接标记底物，克服了铕- APC 组合存在的空间位阻问题。此外，GFP的使用使基于GFP融合蛋白的检测成为可能，甚至可在活细胞中进行。
- Transcreener® TR-FRET 检测：该检测可检测常见生物酶促反应的副产物 ADP、AMP/GMP、UDP 和 GDP。针对每种核苷酸均提供竞争性 TR-FRET 免疫检测试剂盒。通过对这些核苷酸的定量分析，可研究核苷酸依赖性酶的酶活性。Transcreener 检测采用竞争性检测模式：抗体与铽螯合物结合，核苷酸与红色荧光团结合。“天然” ADP、AMP/GMP、UDP 和 GDP 取代示踪剂，从而阻止共振能量转移，因此可通过信号降低来识别靶分子的存在。
- THUNDER TR-FRET：这是一种基于 FRET 对的技术，显示出更强的光谱兼容性和 TR-FRET 信号。THUNDER 检测采用长寿命且稳定性高的铕螯合物作为供体，受体为在远红光谱区发射荧光的小分子荧光团⁵。
表 1 汇总了所有检测技术及其特性，包括激发峰和发射峰。除上述列出的特性外，这些试剂盒的时间间隔和检测窗口也存在差异。
表 1：主流 TR-FRET 检测试剂盒及其激发峰、发射峰对比
| 试剂盒 | 供体 | 笼状结构类型 | 激发波长 | 供体发射波长 | 受体 | 受体发射波长 |
| LANCE | 铕 | 螯合物 | 320 nm | 620 nm | ULightTM | 665 nm |
| LANCE | 铕 | 螯合物 | 320 nm | 620 nm | Surelight® APC | 665 nm |
| LanthaScreen Eu | 铕 | 螯合物 | 320 nm | 620 nm | AlexaFluor 647 | 665 nm |
| LanthaScreen Tb | 铽 | 螯合物 | 340 nm | 490 nm | 荧光素/GFP | 520 nm |
| HTRF Red（Eu） | 铕 | 穴状化合物 | 320 nm | 620 nm | XL665/d2 | 665 nm |
| HTRF Red (Tb) | 铽 | 穴状化合物 |
340 nm | 620 nm | XL665/d2 | 665 nm |
| HTRF Green (Tb) | 铽 | 穴状化合物 | 340 nm | 620 nm | 荧光素/GFP | 520 nm |
| Transcreener TR-FRET |
铽 | 螯合物 | 340 nm | 620 nm | HiLyte647 | 665 nm |
| THUNDER | 铕 | 螯合物 | 620 nm | 620 nm |
试远红染料 |
除使用市售试剂盒外，只要供体发射光谱与受体激发光谱存在足够重叠，TR-FRET 供体和受体对也可自由组合，如应用说明 AN 388《Δ9 - 四氢大麻酚衍生物与 1 型大麻素受体（CB1）的差异性结合》所示。
TR-FRET 酶标仪
时间分辨荧光共振能量转移检测主要通过酶标仪进行。TR-FRET 酶标仪的基本配置包括光源、用于波长选择的激发和发射滤光片，以及光电倍增管（PMT）检测器。此外，除时间分辨荧光检测模式外，酶标仪还需能够单次运行中检测两个发射通道，可采用顺序检测或同时检测方式。由于 TR-FRET 主要用于高通量筛选，因此通常需兼容 384 孔和 1536 孔微孔板。
光源
螯合物或穴状化合物复合物的激发波长通常为 320-340 nm，因此可使用氙气闪光灯或特定的激发激光器作为光源。TRF激光器能将更多能量聚焦于该特定波长范围，从而获得更优结果，可更好地区分低信号与高信号。
PHERAstar FSX 酶标仪配备了频率为 60 赫兹的TRF激光器，为 TR-FRET 检测提供了显著的速度优势。该激光器可在 36 秒内完成一整块 1536 孔板的检测，同时确保细胞检测和生化检测的 Z' 值 > 0.8（图 7），详情请查看《在 1536 孔板中进行的细胞及生化 HTRF 检测》。
在《在 PHERAstar FSX 上进行的 THUNDER™ TR-FRET 细胞因子检测的优异性能》中显示，配备TRF激光器的 PHERAstar FSX 酶标仪相比同类高通量筛选微孔板酶标仪，具有更高的灵敏度和动态范围。
专用检测器
PHERAstar FSX 酶标仪配备了用于 TR-FRET 检测的光子计数检测器（PMTs）。普通检测器输出的是积分时间内曲线下面积的积分值，而光子计数PMT则会对每个光子进行计数，从而监测整个镧系元素的衰变曲线。
在 PHERAstar FSX 酶标仪上，光子计数检测能够以2微秒的时间分辨率进行检测并形成发射衰变曲线。这种被称为 “衰变曲线监测” 的独特功能简化了检测方法的开发，有助于优化时间参数，从而提升检测性能并降低背景信号。结合积分向导（Integration Wizard），衰变曲线监测为 TR-FRET 检测优化提供了平台。
双通道检测
TR-FRET 检测需对两个发射波长进行检测，可采用顺序检测或同时检测方式。通常，酶标仪会依次检测两个发射信号，但同时检测具有多项优势。
PHERAstar FSX 酶标仪的同步双发射（SDE）检测系统采用两个匹配的PMT，可并行测量两个发射波长。这种方式将读数时间缩短了一半，提高了检测通量，同时校正了由加样体积差异、浓度变化或激发能量波动引起的信号变异。这些特性提升了检测灵敏度，降低了变异系数（% CVs）。同步双发射的单通道检测结果会结合起来，用于计算两个发射通道的比率结果。
TR-FRET 检测的微型化
在药物筛选中，检测微型化是关键步骤。微型化旨在减少样品体积，同时保持检测的可重复性、可靠性和稳健性。检测可微型化至 3456 孔板规格，但 384 孔和 1536 孔板仍是最常用的规格。
TR-FRET 检测可实现微型化且保持准确性和可重复性，因为其信号强度不取决于示踪剂的总量，而取决于示踪剂的浓度。使用 PHERAstar FSX 等高灵敏度酶标仪进一步支持了这一特性。
在学术讲座 "成功缩小筛选测定的规模：Servier的经验" 中，我们展示了一个案例研究：PHERAstar FSX 酶标仪极大地推动了 HTRF 检测从 384 孔板到 1536 孔板的微型化进程。在 PHERAstar FSX 上，微型化与试剂进一步稀释和“即时”检测（每孔仅激发一次）相结合，不仅获得了高质量的 Z' 值，还显著减少了试剂用量和时间消耗
激酶活性检测
激酶活性主要通过夹心检测法分析底物的磷酸化变化来评估，如应用说明《采用 THUNDER™ TR-FRET 细胞激酶免疫检测法分析 ERK1/2、p38αβγ 和 STAT3 的磷酸化》中所示。也可采用竞争检测法监测反应产生的不同产物（如 ADP）。此外，还可使用荧光标记的激酶底物和镧系元素标记的抗磷酸化抗体进行检测（图 8），如应用说明《LanthaScreen TR-FRET 酪氨酸激酶和蛋白激酶 C 检测》中所示。这些方法也可应用于蛋白酶和泛素化研究。有关激酶活性检测的更多信息，请查看《激酶检测》。
G蛋白偶联受体（GPCRs）
GPCRs研究检测可分为机制检测和功能检测。功能检测主要侧重于次级信使的定量分析（如 IP1 或 cAMP），这些次级信使可能因特定抑制剂的作用而在细胞内积累。因此，次级信使被用于检测读数，因为其浓度与配体结合及受体激活程度相关，如应用说明《用于功能筛选的 HTRF IP-One 检测》和《采用 Cisbio 公司的 cAMP 和 IP1 HTRF HTplex 细胞检测法测量 GPCR 激活》中所示。机制检测侧重于细胞膜上的受体结构组织和寡聚化，以介导信号传导。
生物标志物
对下游信号转导产物的分析可用于识别可能在神经、代谢和炎症疾病中发挥作用的异常通路。时间分辨荧光共振能量转移可用于检测针对这些疾病的特异性化合物的疗效。应用实例包括：用于代谢性疾病（尤其是 2 型糖尿病）研究的《快速 HTRF 胰岛素检测的开发》、用于神经退行性疾病研究的《人 tau 蛋白聚集的检测》，以及《在 PHERAstar FSX 上进行的 THUNDER™ TR-FRET 细胞因子检测的优异性能》中用于不同疾病细胞因子定量的检测。
在学术讲座《靶向 1 型胆囊收缩素受体筛选新型肥胖治疗药物》中，讨论了如何利用 TR-FRET 检测筛选 IP3 的下游代谢产物肌醇单磷酸的积累，并基于此结果进一步开发了TR-FRET 结合检测。
结合动力学事件分析
由于技术难度较大且通量相对较低，配体与受体的结合动力学研究传统上是在药物研发的后期阶段进行。然而，优化结合动力学研究将使药物研发受益匪浅，因为结合速率（Kₒₙ）和解离速率（Kₒff）会影响药物的有效性、副作用发生率以及作用效能和持续时间。此外，结合动力学似乎在偏向性激动作用中也发挥作用。因此，在进入体内模型研究和临床研究之前，最好在早期筛选药物候选物的结合动力学特性。
结合动力学研究（图 9）可在具备 TR-FRET 动力学检测功能的酶标仪上高效开展，这类酶标仪可用于筛选研究及低亲和力化合物的动力学分析，详情请查看《测量配体 - 受体结合动力学的 TR-FRET 方法及其在片段筛选中的应用》和《采用 HTRF 分析结合动力学》。
