浊度法（Nephelometry）

什么是浊度法？

浊度法（源自希腊语 “nephelo”，意为 “云”）是一种分析化学技术，用于测量溶液中因存在悬浮不溶性颗粒而产生的浊度（或浑浊程度）。

当光线穿过含有悬浮固体颗粒的浑浊溶液时，会发生透射、吸收（被阻挡）和散射（被颗粒反射，见图 1）三种现象。散射光的强度取决于溶液中不溶性颗粒的大小、形状、浓度，以及入射光的波长。

19 世纪末至 20 世纪初，瑞利（Rayleigh）、米氏（Mie）、德拜（Debye）等科学家率先开展了光散射相关的理论与概念研究。

浊度法最初应用于临床化学领域的免疫分析，用于检测和定量血液中的血清蛋白，如免疫球蛋白、大分子物质），这类应用至今仍在使用。将其与酶标仪结合后，该技术主要用于分析物质沉淀现象（见图 2），如药物溶解度、蛋白质聚集，或细菌生长等。

浊度法与比浊法的区别

溶液的浊度可通过浊度法或比浊法进行检测。两种技术均为非破坏性方法，且均基于悬浮固体颗粒产生的光散射现象。尽管这两个术语有时被混用，但从技术层面而言并非完全等同。比浊法通过测量光线穿过样品时，因不溶性颗粒的散射作用导致的光强损失来定量浊度。与吸光度检测原理类似，比浊法通过量化穿过样品的透射光强度（尤其是光的衰减程度）来实现测量：将已知波长的光线穿过含不溶性颗粒的溶液，在光源光轴线上放置检测器，收集透射光（见图 3A）。通过与参比组对比，测量透射光的减弱程度，并以光密度（OD）单位量化被吸收的光。因此，可使用吸光光度计进行浊度测量。

与之相反，浊度法通过直接检测样品中不溶性颗粒散射的光强来确定溶液浊度。为避免透射光的干扰，通常在与入射光源成一定角度的位置测量散射光（见图 3B）。从这一特性来看，其原理与荧光强度检测有相似之处。

浊度法vs比浊法

进行光散射实验时，选择浊度测定法还是比浊法，主要取决于两个因素：

1. 1. 样品浓度与散射光强度

样品中不溶性颗粒的浓度及由此产生的散射光强度（相对于光源强度）是最关键的因素。若样品中不溶性颗粒数量少（低浓度），透射光强度与光源强度接近，此时浊度法是更合适的选择 —— 因为如同分子吸收检测中难以区分两个强信号的微小差异一样，低浓度下比浊法的检测灵敏度不足。反之，当样品中不溶性颗粒浓度高、透射光显著减弱时，比浊法更适用。

1. 2. 散射颗粒的大小

颗粒大小是需考虑的第二个参数，因其会影响光的反射（被阻挡）或散射效果：当颗粒尺寸大于入射光波长时，主要发生反射；当颗粒尺寸与入射光波长相当或更小时，主要发生散射。因此，浊度法最适合检测小颗粒，最佳尺寸为 0.1-1 微米，此时散射作用强于反射作用。而比浊法对颗粒大小的敏感度较低，因为它检测的是透射光的相对减弱程度 —— 即便颗粒尺寸较大导致反射或折射增强，比浊法仍可实现有效检测。

综上，浊度法对低浓度小悬浮颗粒的分析灵敏度更高，更适合此类场景；比浊法则通常用于高浓度较大不溶性颗粒的检测，例如在生物学中常用于测定溶液中的细胞（如细菌）数量 ³。

浊度法的原理

液体中的光散射遵循粒子物理学中的弹性散射规律：在 “碰撞” 过程中，颗粒不吸收能量，光子在散射前后的能量保持不变。不同尺寸的颗粒，其弹性散射特性不同：大颗粒的光散射主要沿正向（前向散射）；当颗粒尺寸小于入射光波长的 5% 时，散射光呈对称分布⁴。

可溶性分子通常尺寸较小（相较于入射光波长），其散射光几乎呈对称分布（见图 4A）；而溶液中的沉淀物、复合物尺寸通常较大（接近入射光波长），主要产生前向散射光（见图 4B）。浊度法的检测通常以测量前向散射光为主。

散射光与颗粒浓度的关系

散射光强度（Iₛ）与沉淀物浓度（C）的关系可通过以下公式表示：

I_S=k_S*I₀* C

其中，kₛ是通过系统校准确定的常数，I₀为入射光强度。

悬浮颗粒体系的物理特性受多种变量影响：尽管散射光强度与溶液中固体颗粒浓度相关，但同时也取决于颗粒的大小和形状 —— 即使浓度相同，含不同尺寸沉淀物的样品也会呈现不同的散射水平。

此外，沉淀物的大小和形状还受温度、pH 值、试剂浓度，以及混合顺序、搅拌方式、沉淀形成至检测的间隔时间等因素影响。为确保不同样品和实验间条件与结果的可重复性，需综合考虑所有这些变量⁴⁻⁵。

光源波长

通常情况下，无需特别选择波长 —— 只要入射光不会诱导样品产生荧光，一般不考虑悬浮颗粒对入射光的吸收。因此，若使用非荧光样品，对波长无特殊要求；波长的选择主要基于尽量减少潜在干扰，而不是影响入射光或散射本身的强度。⁴。

浊度法的仪器设备如何进行检测？

尽管荧光酶标仪可用于浊度检测，但光散射的角度依赖性促使了专用设备的研发。检测器与入射光束成一定角度的比浊仪被称为浊度仪（nephelometers），是测量低浊度值的标准仪器 —— 这类仪器仅测量散射光强度，不检测透射光。

浊度仪的基本组件包括光源、光散射光学系统和检测器：

光源：产生入射光束并穿过样品，可选用卤素灯、氙灯或激光器。其中激光器因灵敏度高、光强高、相干性好（发射的光子相位一致），是最常用的选择。入射光与散射光波长相同，因此无需进行光学波长选择。

检测器：位于光源对面且与入射光束成一定角度，根据位置不同，可检测前向散射光或侧向散射光。为最大化散射光收集效率，检测器通常设置在 30°、70° 或 90° 角位置。

检测模式

浊度法可采用终点检测或动力学检测两种模式：

终点检测：对反应达到平衡时，或在预设时间点的最大散射光强度进行定量。

动力学检测：在整个沉淀过程中进行多次读数，通常能提供更多关于反应过程的信息。

浊度法的应用

临床领域

20 世纪 70 年代起，免疫浊度法开始应用于临床实验室的免疫分析，最初用于检测免疫复合物（抗原 - 抗体）的形成与沉淀，该应用至今仍在使用。此外，免疫浊度法还可用于定量血清蛋白（包括免疫球蛋白），并可整合到高通量自动凝血仪中 —— 这类仪器可对血液样本中的凝血因子进行定量检测，实现多项目凝血功能检测。

制药领域

在制药实验室中，浊度法主要用于评估药物或化合物的溶解度；同时，它也是定量微生物生长的理想方法，常用于测定微生物悬浮液（如酿酒酵母 S. cerevisiae）的细胞数量⁶。

基于微孔板的浊度法

浊度法也可在微孔板中进行检测（见图 5）。这种形式对生命科学实验室和制药行业尤为有利，因为基于微孔板的样品与化合物处理方式，可同时提升实验效率与通量。且基于微孔板的浊度仪通常能以更高通量、更简化的操作和更少的样品用量，完成浊度数据采集。
BMG LABTECH 研发的NEPHELOstar Plus，是全球首款基于微孔板的激光浊度检测设备。该仪器通过测量激光束穿过样品时产生的前向散射光来检测微孔中溶液的颗粒。

在光源方面，高度准直的激光二极管提供了可调节的强度和光束直径 —— 这些特性不仅能减少弯月面带来的干扰，还能优化检测灵敏度，支持 384 孔板规格的检测。

NEPHELOstar Plus 的检测原理如下：激光束穿过样品孔后，进入位于微孔板下方的乌尔里希球（Ulbricht sphere，又称积分球） 。该球体可收集其内壁任意点接收到的散射光，并通过多次反射将光均匀分布到球体其他所有位置。乌尔里希球可收集角度最大达 80° 的散射光，在保留光强的同时最大限度地减小了原始散射角的影响，从而消除空间信息，产生可被检测器量化的漫射光（见图 6）。

若孔中沉淀物未使光束发生偏转，光束将直接穿过乌尔里希球，不产生反射，因此无信号到达检测器；
若样品中存在颗粒，光线就会发生散射，并在乌尔里希球内壁反射，最终被与入射光成 90° 角的检测器所捕获（见图 7）。

浊度单位

浊度通常以NTUs（浊度测定单位，Nephelometric Turbidity Units） 表示，尤其在水质检测中。NTU 值需通过校准后的仪器，对比福尔马肼（formazin）参比悬浮液的测量结果得出 —— 但这种方法步骤繁琐、耗时，且需要大量样品。

NEPHELOstar Plus 的检测结果以RNUs（相对浊度单位，Relative Nephelometric Units） 表示。关于 NTU 与 RNU 的换算方法，可参考应用说明《使用 NEPHELOstar Plus 提升浊度测定单位（NTUs）检测通量》（“Improving throughput for assessing nephelometric turbidity units (NTUs) using the NEPHELOstar Plus”）。两种单位的相关性如图 8 所示：。

微孔板的质量要求

浊度测定实验通常使用 96 孔或 384 孔微孔板，微孔板的光学质量至关重要：孔底的灰尘、污渍、指纹或划痕等瑕疵会导致光线散射，可能产生假阳性信号、缩小实验检测窗口，或显著降低检测灵敏度。因此，通常应排除那些信号值异常高（或高于空白组均值加 2 倍标准差）的孔的数据⁷。

基于微孔板的浊度法应用场景

基于微孔板的浊度法是制药行业的重要工具，尤其适用于高通量化合物溶解度筛选。此外，该技术还可用于：微生物生长监测、蛋白质结合动力学分析、体液中钙化倾向测量、血清中类风湿因子检测、抗原 - 抗体结合检测（见图 9）等多个领域。

药物溶解度实验

在制药行业，高通量筛选是药物研发的重要手段，而溶解度评估是验证药理结果有效性和筛选潜力化合物的必要步骤。药物溶解度对药物的生物利用度、制剂工艺、给药剂量和吸收效果均有重要影响。因此，在药物研发早期进行溶解度分析非常中亚，可避免对低溶解度化合物进行耗时且昂贵的药代动力学 / 药效学（ADME）筛选。

传统的平衡溶解度实验通量较低：通过将化合物与溶剂混合振荡、孵育至少 24 小时后，过滤处理，再通过高效液相色谱（HPLC）测定浓度，已无法满足现代药物研发的需求。

如今，基于微孔板的浊度测定仪可进行自动化动力学溶解度筛选，可在更短时间内实现更高通量的筛选。该方法将待检测化合物在水溶液中进行系列稀释后加至微孔板，通过光散射检测未溶解的沉淀物。高浓度下，化合物会沉淀导致溶液浑浊，RNUs 值升高；只要浓度高于溶解度阈值，化合物就会持续沉淀；当浓度低于溶解度阈值时，化合物完全溶解，溶液澄清，散射光强度和 RNUs 值显著降低。通常会对数据进行 “溶解相” 与 “不溶解相” 的双线性拟合，两条拟合线的交点即为动力学溶解度点（见图 10）。

该方法的优势在于实验速度快、操作简便。仅需移液步骤，无需进行过滤或分离溶液与未溶解残渣；且实验设置与检测可在同一块微孔板中完成，无需转移液体；此外，还能同时测定化合物的溶解浓度阈值与开始沉淀的浓度阈值。

通常，该方法对颗粒浓度的检测信号线性范围可达 3 个数量级，动力学溶解度实验的检测限约为 20 mmol/L⁸。

微生物生长监测

基于微孔板的浊度法也可替代基于吸光度的 OD600 微生物生长检测法。随着细菌繁殖，溶液中悬浮的细胞数量增加，散射光强度和 RNUs 值随之升高。通常通过对培养物进行系列稀释，建立光密度与 RNUs 值的关联。浊度法与吸光度法的检测效果相当，且灵敏度通常更高。

应用说明《通过激光浊度法监测微生物生长曲线》（Monitoring of microbial growth curves by laser nephelometry）和《用浊度法监测白色念珠菌生长》（Nephelometric monitoring growth of Candida albicans）（见图 11），展示了如何使用 NEPHELOstar Plus 高效测定微生物生长曲线。