NEPHELOstar Plus
光散射和浊度检测的激光微孔板浊度分析仪
什么是浊度法？
浊度法（Nephelometry，源自希腊语 “nephelo”，意为“云”）是一种分析化学检测技术，用于测定溶液中因悬浮不溶性颗粒存在而产生的浊度（或浑浊程度）。
当光线通过含有悬浮颗粒的浑浊溶液时，会同时发生透射、吸收（光被颗粒阻挡）以及散射（光被颗粒偏转）三种现象（见图1）。其中，散射光的强度取决于不溶性颗粒的粒径、形状、浓度以及入射光波长等参数。
19世纪末至20世纪初，瑞利（Rayleigh）、米氏（Mie）和德拜（Debye）等科学家系统发展了光散射相关理论，为浊度测量奠定了基础。
浊度法最初应用于临床化学免疫分析，用于检测和定量血液中的血清蛋白，如免疫球蛋白及其他大分子物质，该类应用至今仍在广泛使用。结合酶标仪应用后，该技术主要用于分析体系中的沉淀与颗粒形成过程（见图2），例如药物溶解度研究、蛋白质聚集行为以及细菌生长 监测等。
浊度法与比浊法的区别
溶液浊度的检测可通过浊度法（nephelometry）或比浊法（turbidimetry）实现。两者均属于非破坏性光学检测方法，且均以颗粒对入射光的散射作用为物理基础，但在信号采集模式上存在本质差异。
比浊法基于透射光衰减进行定量分析，即通过测定入射光穿过样品后的光强降低来间接反映颗粒浓度。该方法与吸光度检测原理高度相似：使用特定波长光源垂直照射样品，并在光路轴向设置检测器以采集透射光信号（见图3A）。通过与空白对照比较透射光衰减程度，并以光密度（OD） 进行定量，因此可采用常规分光光度计 进行检测。
相比之下，浊度法则直接采集颗粒散射光信号。为降低透射光及背景光干扰，检测器通常设置于与入射光成特定夹角（常见为90°或其他优化角度）的位置，以选择性检测散射光强度（见图3B）。因此，其检测几何结构与信号获取模式在原理上接近荧光强度检测。
浊度法vs比浊法
进行光散射实验时，选择浊度法还是比浊法，本质上取决于检测体系的散射信号特征与颗粒物理属性，核心可归纳为以下两个判据：
- 1. 样品浓度与散射信号强度
不溶性颗粒的浓度及其引发的散射光强（相对于入射光强）是决定检测策略的首要参数。在低颗粒浓度条件下，体系对入射光的衰减较小，透射光强接近光源强度，此时基于透射光差异的比浊法难以分辨微弱变化，信噪比受限。因此，采用直接检测散射光的浊度法更具优势，可显著提升低信号区间的检测灵敏度。相反，在高颗粒浓度条件下，多重散射及光衰减效应显著，透射光强明显降低，此时比浊法能够通过透射光的整体衰减实现稳定定量，方法上更为适用。
- 2. 散射颗粒的粒径尺度
颗粒粒径决定了光与物质相互作用的主导机制。当颗粒尺寸大于入射光波长时，光学过程以反射与折射为主；当颗粒尺寸与波长相当或更小时，则以散射（Rayleigh 或 Mie 散射）为主。基于此，浊度法更适用于检测小尺寸颗粒，尤其在 0.1–1 μm 范围内具有最佳响应区间，此时散射信号占主导，有利于提高检测灵敏度与分辨能力。而比浊法对粒径变化的敏感性相对较低，其测量本质为透射光的整体衰减，即使在大颗粒导致反射/折射增强的情况下，仍可进行检测。
综上，浊度法对低浓度小悬浮颗粒的分析灵敏度更高，更适合此类场景；比浊法则通常用于高浓度较大不溶性颗粒的检测，例如在生物学中常用于测定溶液中的细胞数量 ³。
浊度法的原理
液体体系中的光散射过程可由粒子光学中的弹性散射理论描述。在散射过程中，光子与颗粒发生相互作用，但不发生能量交换，因此散射前后光子的能量（或波长）保持不变。颗粒的尺寸、形貌及其与入射光波长的相对关系，共同决定了散射的角分布特征。对于不同尺度的颗粒，其散射行为存在显著差异：当颗粒尺寸远小于入射光波长（通常 <5% λ）时，体系主要表现为近似各向同性的对称分布⁴ ；而随着颗粒尺寸增大，散射逐渐向前向集中，前向散射占主导地位。
在溶液体系中，可溶性分子通常尺寸远小于入射光波长，因此其散射光呈近似对称分布（见图4A）。相比之下，沉淀物、蛋白聚集体或复合颗粒等结构尺寸较大，接近或超过入射光波长范围，因而表现出明显的前向散射特征（见图4B）。基于上述散射特性，浊度法的信号采集通常优先选择前向散射光或近前向散射光，以提高对颗粒形成与增长过程的响应灵敏度与动态范围。
散射光与颗粒浓度的关系
散射光强度（Iₛ）与沉淀物浓度（C）的关系可通过以下公式表示：
IS=kS*I0* C
其中，kₛ为由系统光学条件及仪器参数校准得到的比例常数，I₀为入射光强度。
悬浮颗粒体系的物理特性受多种变量影响：尽管散射光强度在一定范围内与颗粒浓度呈正相关，但其绝对值同时显著依赖于颗粒的尺寸分布与形貌特征。因此，在相同浓度条件下，不同粒径或聚集状态的沉淀体系仍可能表现出显著差异的散射信号强度。
此外，颗粒形成过程本身受多种实验变量调控，包括温度、pH、试剂浓度，以及混合顺序、搅拌方式和从沉淀生成到检测之间的时间间隔等。这些因素共同影响颗粒的成核与生长过程，从而进一步改变其散射行为。 为确保不同样品和实验间条件与结果的可重复性，需综合考虑所有这些变量⁴⁻⁵。
光源波长
通常情况下，浊度测定对入射光波长并无严格限制。只要入射光不会诱导样品产生荧光背景信号，无需重点考虑悬浮颗粒对光的吸收影响。因此，在非荧光体系中，波长选择通常不作为关键优化参数。在实际应用中，波长的设定主要基于降低潜在背景干扰与系统噪声的原则，而非用于调控或增强散射信号本身。换言之，波长选择的核心目标是保证信号检测的稳定性与可重复性，而非改变散射过程的物理强度⁴ 。
浊度检测的仪器系统与工作原理
尽管荧光酶标仪 在一定条件下可用于浊度信号检测，但由于光散射信号具有显著的角度依赖性，专用检测系统被进一步开发。因此，将检测器置于与入射光束成特定角度的光学系统被定义为浊度仪（nephelometers） 。该类仪器的核心特征在于仅采集散射光信号，而不检测透射光，从而实现对低浊度体系的高灵敏度分析。
浊度仪主要由三部分组成：光源、光学散射检测系统以及信号检测器。
光源：用于产生稳定的入射光束并穿过样品池，常见光源包括卤素灯、氙灯及激光器。其中，激光器因具有高光强、高方向性及良好的相干性（光子相位一致），在高灵敏度检测中应用最为广泛。由于散射光与入射光具有相同的波长，无需进行复杂的波长选择。
检测器：
位于与入射光轴成一定夹角的位置，用于选择性采集散射光信号。根据几何布局不同，可分别检测前向散射或侧向散射光。为优化信号采集效率，常见检测角度包括30°、70°及90°等配置。
检测模式
浊度法可采用终点检测或动力学检测两种模式：
终点检测（end-point measurement）：在反应达到平衡状态，或在预设时间点对散射光强度进行单点定量分析，用于获得体系的最终浊度值。
动力学检测（kinetic measurement）：在沉淀或颗粒形成的整个过程中进行连续或多时间点采集，通过时间分辨信号曲线表征体系变化过程，可提供更完整的反应动力学信息。
浊度法的应用
临床领域
自20世纪70年代起，免疫浊度法逐步应用于临床实验室的免疫分析领域，最初用于检测抗原-抗体复合物的形成及其沉淀过程，该方法至今仍广泛应用于相关检测。此外，免疫浊度法亦可用于血清蛋白的定量分析（如免疫球蛋白等），并可集成于高通量自动凝血仪中，用于血液样本中凝血因子的定量检测，从而支持多指标凝血功能的高通量分析。
制药领域
在制药研究与质量控制实验室中，浊度法主要用于评估药物及化合物的溶解度特性。同时，该方法也广泛应用于微生物生长的定量分析，是测定微生物悬浮体系（如酿酒酵母 S. cerevisiae）细胞密度的常用手段⁶
基于微孔板的浊度法
浊度检测同样可在微孔板 中实现（见图5）。该形式尤其适用于生命科学研究及制药筛选流程，可结合微孔板处理体系显著提升实验通量与操作效率。同时，基于微孔板的浊度检测系统通常能够在减少样品消耗的前提下，实现高通量、自动化的浊度数据采集与分析。
BMG LABTECH 研发的NEPHELOstar Plus，是全球首款基于微孔板平台的激光浊度检测系统。该仪器通过测量激光穿过样品后产生的前向散射光，实现对微孔体系中颗粒形成与分布的灵敏检测。
在光源系统方面，仪器采用高度准直的激光二极管，具备可调光强与可变光束直径等特性。这些设计不仅可有效降低弯月面效应带来的光学干扰，同时显著提升检测灵敏度，并支持384孔板规格的高通量分析需求。
NEPHELOstar Plus 的检测原理如下：激光束穿过样品孔后，散射光被引导进入位于微孔板下方的 Ulbricht 球（Ulbricht sphere，又称积分球）。该结构可对入射光进行多次内部反射，使其在球体内壁均匀扩散，从而实现对不同角度散射光的高效收集。积分球可收集最大约80°范围内的散射光信号，在保持光强的同时弱化原始散射角分布的影响，将空间角度信息转化为可量化的漫射光信号（见图6）。
若孔中沉淀物未使光束发生偏转，入射激光束保持原有传播路径，无法在积分球内壁形成可被收集的光信号，检测器端亦无响应输出。
当样品中存在悬浮颗粒或沉淀物时，入射光发生散射并在积分球内部多次反射，经由球壁均匀扩散后被重新分布至检测区域。最终，部分散射光信号被与入射光呈90°几何布置的检测器捕获（见图7）。
浊度单位
浊度通常以 NTU（Nephelometric Turbidity Units，浊度测定单位）表示，广泛应用于水质分析等标准化检测领域。NTU 值通常通过经校准的浊度仪，以福尔马肼（formazin）标准悬浮液作为参比溶液进行标定获得。然而，该方法流程相对复杂，检测耗时较长，且对样品与标准品用量要求较高。
NEPHELOstar Plus 的检测结果以RNUs（相对浊度单位，Relative Nephelometric Units） 表示。关于 NTU 与 RNU 的换算方法，可参考应用说明《使用 NEPHELOstar Plus 提升浊度测定单位（NTUs）检测通量》（“Improving throughput for assessing nephelometric turbidity units (NTUs) using the NEPHELOstar Plus”）。两种单位的相关性如图 8 所示：。
微孔板的质量要求
浊度测定实验通常采用96孔或384孔微孔板进行高通量检测。在此类应用中，微孔板的光学质量是影响数据可靠性的关键因素之一。孔底或光学路径中的微小缺陷（如灰尘、污渍、指纹或机械划痕）均可能引发额外光散射，从而产生背景干扰信号，导致假阳性结果、动态检测窗口压缩或整体灵敏度下降。因此，在数据分析过程中通常需要对异常孔进行质量控制筛选，例如剔除信号显著偏离整体分布的孔（如高于空白对照均值±2倍标准差的孔）⁷，以提高结果的稳定性与可重复性。
基于微孔板的浊度法应用场景
基于微孔板的浊度检测方法已成为制药研发中的重要分析工具，尤其适用于高通量化合物溶解度筛选与初筛评价。此外，该方法还广泛应用于多种生物与化学过程监测，包括微生物生长动力学分析、蛋白质结合动力学分析 、体液钙化倾向评估、血清类风湿因子检测以及抗原-抗体结合反应分析等（见图 9）。
药物溶解度实验
在制药行业，高通量筛选是药物研发的重要手段，而溶解度评估是验证药理结果有效性和筛选潜力化合物的必要步骤。药物溶解度直接影响其生物利用度、制剂可行性、给药剂量设计及体内吸收效率。 因此，在药物研发早期阶段开展系统性溶解度分析至关重要，可有效避免对低溶解度化合物进入后续耗时且成本较高的ADME（吸收、分布、代谢与排泄）筛选流程。
传统平衡溶解度测定方法通量较低，通常通过将化合物与溶剂混合振荡并孵育至少24小时，随后经过滤处理，并采用高效液相色谱（HPLC）进行终点浓度测定。这一流程难以满足现代药物研发对高通量与快速决策的需求。
相比之下，基于微孔板的浊度检测系统可实现自动化动力学溶解度筛选，在显著缩短实验时间的同时大幅提升通量。该方法通过将待测化合物进行梯度稀释后加入微孔板体系，利用光散射信号检测未溶解颗粒的形成情况。在高浓度条件下，化合物超过溶解度阈值后发生沉淀，使体系浑浊度上升，表现为RNU值增加；当浓度低于溶解度阈值时，化合物完全溶解，体系趋于澄清，散射信号及RNU值显著下降。通常通过对“溶解相”与“不溶解相”进行双线性拟合分析，两条拟合曲线的交点即定义为动力学溶解度点（见图10）。
该方法的优势在于实验流程快速且操作简便。实验过程中仅需基础移液步骤，无需进行过滤或固液分离操作；同时，样品制备与信号检测可在同一微孔板中完成，避免了液体转移带来的误差与污染风险。此外，该方法能够同时解析化合物的溶解浓度阈值与初始沉淀发生浓度阈值。
通常，该方法对颗粒浓度的检测信号具有约3个数量级的线性响应范围，动力学溶解度实验的检测上限约为 20 mmol/L⁸。
微生物生长监测
基于微孔板的浊度法也可替代基于吸光度的 OD600 微生物生长检测法。随着细菌繁殖，溶液中悬浮的细胞数量增加，散射光强度和 RNUs 值随之升高。通常通过对培养物进行系列稀释，建立光密度与 RNUs 值的关联。浊度法与吸光度法的检测效果相当，且灵敏度通常更高。随着细菌持续增殖，培养体系中悬浮细胞数量逐渐增加，引起散射光强度及RNU值同步升高。通常通过对培养体系进行梯度稀释，并建立光密度（OD）与RNU信号之间的对应关系，实现定量关联。
相关应用说明《通过激光浊度法监测微生物生长曲线》（Monitoring of microbial growth curves by laser nephelometry）和《用浊度法监测白色念珠菌生长》（Nephelometric monitoring growth of Candida albicans）（见图 11），展示了如何使用 NEPHELOstar Plus 高效测定微生物生长曲线。
